Диагностика амилоидоза: аспираты подкожного жира и мониторинг амилоидоза
Тонкоигольная аспирация подкожного жира
В прошлом биопсия десны или подслизистой прямой кишки рассматривалась в качестве золотого стандарта для диагноза системного амилоидоза (Westermark P. 1995). В настоящее время в качестве скрининга используется выявление фибрилл амилоида в подкожном жире, получаемом тонкоигольной аспирацией (Duston, M. A., Skinner, M., Meenan, R. F., Cohen, A. S. 1989 van Gameren, I. I., Hazenberg, B. P., Bijzet, J., vanRijswijk, M. H. 2005 Westermark, P., Davey, E., Lindbom, K., Enqvist, S. 2006).
Эта методика была предложена в 1973 году Westermark и Stenkvist и стала предпочтительным диагностическим методом благодаря своей простоте, низкой цене и отсутствию значимых осложнений в сочетании с хорошей чувствительностью и специфичностью (Gertz MA, Li CY, Shirahama T, Kyle RA. 1988; Klemi PJ, Sorsa S, Happonen RP.). Однако полезность метода аспирации в целях специфического типирования отложенного амилоидного белка до конца не определена, поэтому этот метод часто рассматривается как скрининг амилоидоза при неясной клинической картине (Picken MM. 2007).
Тонкоигольчатая аспирация абдоминального жира является простой процедурой, которая позитивна для амилоидных депозитов примерно у 70% больных с AAL (Libbey CA, Skinner M, Cohen AS 1983; Ansari-Lari MA, Ali SZ 2004). При этом амилоид представляется как аморфная эозинофильная субстанция, которая окрашивается в оранжевый цвет при окраске конго рот и обнаруживает характерное яблочно-зеленое лучепреломление при поляризационной микроскопии. Чувствительность обследования можно повысить несколькими методами. Во-первых, использование большого размера игл, используемых для аспирации.
Важно заметить, что хотя используемые размеры игл могут быть «большими» или «меньшими», но отчасти представляется ошибочным сам термин «тонкоигольная аспирация абоминального жира», используемый в ряде публикаций (Westermark P, Stenkvist B. 1973, Ansari-Lari A, Ali SZ. 2004; Guy C, Jones C. 2001; MasouyeI. 1997; Giorgadze TA, Shiiana N, Baloch ZW, et al 2004). Диагностические возможности, вероятно, могут варьировать согласно используемым размерам игл. Так, анализ литературы подтверждает, что в большинстве работ используются 21-23 размеры игл, и иглы этих размеров в опытных руках могут обеспечить хорошую диагностическую чувствительность. Рядом авторов рекомендуется использовать иглы не менее 21 размера игл для аспирации в среднем с пятью присасываниями. В ряде исследований иглы для аспирации брались еще толще и соответствовали 18 размеру (Guy C, Jones C. 2001;Giorgadze TA, Shiiana N, Baloch ZW, et al 2004). Возможно что 19-21 размер являются оптимальными размерами игл для аспирации. Надо подчеркнуть, что 22-размер игл был использован в основной работе Westermark и Stenkvist, которая популяризировала полезность аспирации жира для диагноза амилоидоза (Westermark P, Stenkvist B. 1973).
Другим возможным объяснением являются строгие критерии, по которым оценивались положительные результаты окраски конго рот, уровень опыта в интерпретации окраски конго рот и технические проблемы. Корректная интерпретация окраски конго рот требует опыта и отчасти субъективна. Van Gameren при оценке результатов аспирации жира рекомендовал рутинное независимое исследование положительных, окрашенных конго рот образцов, для повышения чувствительности (Van GamerenII, Hazenberg BP, Bijzet J, van Rijswijk M. 2006). Ложно негативные результаты могут быть связаны с вариабельной или бледной окрашиваемостью ткани. Другая проблема состоит в преимущественном отложении амилоида во внутренних органах в зависимости от типа амилоидоза. Например, транстиретиновый тип амилоидоза имеет преимущественное проявление со стороны сердца. Отложения к коже оказываются спорадическими даже в развернутой фазе нескольких типов наследственного амилоидоза (Picken MM, Linke RP. 2009). Наблюдения Halloush RA , Lavrovskaya E., Mody D Retal (2009), однако, не проливают достаточно света в этом направлении. Эти обусловлено тем обстоятельством, что большинство исследованных случаев - это AAL тип амилоидоза. Специфичные хронические воспалительные заболевания, которые, как известно, ассоциируются с АА типом не были отмечены у кого-либо из изученных пациентов.
Среди пациентов с AAL были получены как позитивные, так и негативные результаты аспираций жира. Представляется, что количество подкожных амилоидных отложений, которое связаны с длительностью системного амилоидоза, может быть другой определяющей диагностического заключения. К несчастью, в большинстве наблюдений длительность амилоидоза неизвестна, и осталось невыясненным в каких случаях диагностическое заключение по результатам аспираций обусловлено ранним или развитым амилоидозом. Скудное количество ткани в клеточных блоках или мазках может быть также рассмотрено как фактор недостаточной чувствительности. Использование высококачественного поляризационного инструментария, максимальная световая интенсивность и соответствующая толщина срезов для клеточных блоков (порядка 10 микрон) все является важным условием для точного диагноза. Другой вопрос практического значения - это адекватность образца. Как показано Shidhametal., электронная микроскопия может помочь в определении амилоида в аспиратах, когда световая микроскопия, включая конго рот окрашивание, оказывается недостаточно диагностичной (Shidham VB, Kumar N, Cihlar Ketal. 2007).
Результаты одиночного исследования часто не являются клинически окончательными и требуют повторных биопсий процедур для определения амилоидоза. В целом, результаты биопсии жира зависят от степени клинического подозрения у лечащего врача. Хотя в большинстве случаев диагноз амилоидоза не изменяет стратегии лечения, но окончательный положительный результат может исключить другие подлежащие причины как причину симптомов у пациента.
Биомаркеры прогноза и ответа на лечение амилоидоза при моноклональной гаммапатии
Точное определение типа амилоидоза у каждого пациента является критическим шагом в установлении прогноза заболевания и при планировании терапевтической стратегии. Хотя в настоящее время нет возможности излечить амилоидоз, но современное лечение устраняет клетки, которые синтезируют белки-предшественники, и может ограничить дальнейшее отложение белка и улучшить в целом функцию органов. Так, при AAL, который результируется от моноклональных легких цепей, синтезируемых неопластическим клоном плазматических клеток, лечение должно включать химиотерапию и трансплантацию стволовых клеток. При АА амилоидозе – состоянии, ассоциируемом с хроническим воспалением или инфекцией, лечением выбора является контроль подлежащего воспаления/инфекции. При семейном амилоидозе, что результируется от множества амилоидогенных белков, синтезируемых в печени, трансплантация печени обеспечит нормальные белки вместо мутантных белков (Rajkumar SV, Gertz MA. 2007).
До разработки высокодозной терапии прогноз AAL был крайне неблагоприятным. В большинстве исследований, использующих современную химиотерапию, показана средняя выживаемость между 13 и 18 мес (Gertz MA, Lacy MQ, Lust JA, et al 1999, Kyle RA, Gertz MA, Greipp PR, et al 1997; Skinner M, Anderson J, Simms R, et al1996). Пациенты с вовлечением сердца имеют наихудший прогноз и часто умирают от болезни в пределах 6 мес после диагноза. К счастью, недавние результаты лечения изменили прогноз при этом заболевании. Долговременная ремиссия и выживание могут быть достигнуты высокодозной терапией мелфоланом с последующей трансплантацией аутологичных стволовых клеток (Skinner M, Sanchorawala V, Seldin DC, et al 2004). Наибольшее по числу наблюдений исследование продемонстрировало среднюю выживаемость 4.6 года. Преимуществом аутологичной трансплантации является быстрое начало гематологического и органного ответа. Skinneretal. (Skinner M, Sanchorawala V, Seldin DC, et al 2004) показали, что 40% этих пациентов достигают 50% уменьшения в сывороточном моноклональном белке или в свободных легких цепях. В почках ответ на терапию характеризуется более, чем 50% уменьшении протеинурии и <25% снижении почечной функции во времени, что сочетается с лучшим выживанием (Dember LM, Sanchorawala V, Seldin DC, et al 2001; Leung N, Dispenzieri A, Fervenza FC, et al 2005).
Главным недостатком высокодозной терапии являются осложнения, которые достигают 25-40% (Moreau P, Leblond V, Bourquelot P, et al 1998 Mollee PN, Wechalekar AD, Pereira DL, et al 2004). Вызванная лечением летальность составила 13% в этой группе больных. К несчастью, те пациенты, которые имеют тяжелые органные дисфункции и особенно нуждаются в активной терапии, имеют наиболее высокий риск осложнений терапии.
Поэтому важно понять факторы, которые влияют на ответ со стороны внутренних органов для лучшего исходного отбора пациентов для высокодозной терапии. Скорость прогрессирования заболевания при AAL вариабельна. Степень вовлечения внутренних органов, прогрессия заболевания и ответ на терапию могут быть оценены согласно Consensus Criteria (Gertz MA, Comenzo R, Falk RH, et al 2005). При инвариантном анализе было установлено, что низкий сердечный тропонин Т, высокий альбумин, низкий уровень протеинурии и наличие гематологического ответа сочетаются с положительным ответом со стороны почек. При мультивариантном анализе только низкий сердечный тропонин и низкий уровень протеинурии предсказывали положительный почечный ответ. Ответ со стороны почек ассоциируется с удлинением времени выживания по сравнению с гематологическим ответом. Выраженная протеинурия с высоким сердечным Т тропонином негативно связаны с ответом почек после трансплантации аутологичных стволовых клеток (Leung N, Dispenzieri A, Lacy MQ, et al 2007).
Наличие клинически очевидных признаков вовлечения сердца - важнейшая детерминанта исхода. Структурное ремоделирование левого желудочка в виде изменения массы, объема и геометрии полости левого желудочка является важнейшим предиктором функционального и клинического исхода основных заболеваний сердца (Elhendy A, Modesto KM, Mahoney DW, et al 2003; McMurray J, Pfeffer MA. 2002; Gaballa MA, Goldman S. 2002; Udelson JE, Konstam MA. 2002). Значения BNP в сыворотке, как было установлено в ряде исследований, коррелируют с прогнозом (Dispenzieri A, Gertz MA, Kyle RA, et al 2004) и ответом на терапию (Palladini G, Campana C, Klersy C, et al 2003; Dispenzieri A, Gertz MA, Kyle RA, et al 2004; Dispenzieri A, Gertz MA, Kyle RA, et al 2004). Сывороточная концентрация Н-терминального про-мозгового натриуретического пептида, или самого по себе (Palladini G, Campana C, Klersy C, et al 2003) или в сочетании в уровнем сердечных тропонинов (Dispenzieri A, Gertz MA, Kyle RA, et al 2004), как было установлено в данных работах, является чувствительным маркером сердечной недостаточности при AAL и строгим предиктором выживания после высокодозной терапии.
Иммунохимический метод определения свободных легких цепей при плазмоклеточных дискразиях, включая множественную миелому и AAL, показал хорошие результаты, особенно для оценки терапевтического результата химиотерапии (Drayson M, Tang LX, Drew R, et al., 2001; Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, et al., 2001; Katzmann JA, Clark RJ, Abraham RS, et al., 2002; Abraham RS, Katzmann JA, Clark RJ, et al., 2003; Lachmann HJ, Gallimore R, Gillmore JD, et al., 2003). У больных, получивших курсовую терапию ВАД, через 1-2 мес уровень СЛЦ оказался 162,4 +/-96,8 мг/л (р<0.05) и через 3 мес 78,6+/-58,6 мг/л (р<).05) , что заметно ниже исходного уровня 299,0 +/-184,4 мг/л (Matsuda M, Yamada T, Gono T, et al 2005).
Определение сывороточных свободных цепей может оказаться эффективнее для прогнозирования и лечения системного AAL по сравнению с электрофорезом белка и методом иммунофиксации, поскольку имеет более высокую чувствительность и легко поддается количественной оценке. Электрофорез сывороточных белков и иммунофиксация типично имеют пределы от 500 до 2000 мг/л и от 150 до 500 мг/л соответственно, в то время как сывороточный анализ СЛЦ обычно обнаруживает величины свыше 5 мг/л (Lachmann HJ, Gallimore R, Gillmore JD, et al. 2003). Нормативы для каппа цепей 3.3-19,4 мг/л, лямбда 5,7-26,3 мг/л с отношением каппа/лямбда 0,26-1.65. Эти данные подтверждают, что анализ СЛЦ имеет преимущество перед иммунофиксацией по чувствительности к определению М белка.В работе MatsudaM, YamadaTGonoT, etal (2005) сывороточный уровень амилоидогенных СЛЦ оказался повышен с или без нарушенного каппа/лямбда отношения у 24 пациентов (96%), включая 5 больных с М-белком, неопределяемым в сыворотке и моче методом иммунофиксации. В целом, сывороточный уровень СЛЦ зависит от почечной функции и иногда увеличиваются в связи со сниженной гломерулярной фильтрацией (Lachmann HJ, Gallimore R, Gillmore JD, et al. 2003, Clark RJ, Katzmann JA, Abraham RS, et al 2001). Высокая концентрация уровня свободных легких цепей, что было показано недавно, может указывать на неблагоприятный исход (Dispenzieri A, Lacy MQ, Katzmann JA, et al 2006), и значительное снижение в уровне СЛЦ после лечения подлежащей плазмаклеточной дискразии сочетается как с уменьшением уровня Н-терминальном про-мозгового натриуретического пептида, так и с улучшением в выживании (Palladini G, Lavatelli F, Russo P, et al 2006). Гематологический ответ на высокодозную терапию может быть оценен для больных, у которых уровень свободных легких цепей иммуноглобулина оказывается исходно выше 100 мг/л. Частичный ответ СЛЦ на лечение определяется при условии >50% снижения вовлеченного моноклонального класса. Полный ответ СЛЦ определяется как нормализация каппа/лямбда отношения и сывроточных концентраций обоих классов легких цепей. По наблюдению Dispenzieri A, Zhang L, Katzmann JA, et al. (2008), результаты ответа СЛЦ после двух месяцев терапии оказались точнее, чем измерение М-белка в предсказании окончательного ответа на терапию. Но корреляция между серийно определяемыми уровнями СЛЦ в сыворотке и М-белком в моче оказалась недостаточной, чтобы отменить серийное 24-часовое измерение белка в моче. Идеальными результатами терапии является уменьшение СЛЦ на 40-50%. Базальные уровни СЛЦ также оказались прогностичны для всех болезней плазматических клеток, и, прежде всего, для впервые выявленной ММ, но серийные исследования СЛЦ не добавляют новой информации у больных , которую обеспечивает М-белок, измеряемый электрофорезом (Dispenzieri A, Zhang L, Katzmann JA, et al. 2008).
Хотя согласно отдельным работам, анализ СЛЦ позволяет идентифицировать сывороточный моноклональный белок у 98% пациентов с AAL (Lachmann HJ, Gallimore R, Gillmore JD, et al. 2003), но накопленный опыт выявил известные трудности в оценке органного и гематологического ответа на лечение у больных с AAL. Гематологический ответ на терапию не всегда удается измерить, поскольку у многих больных с AAL нет достаточно определяемого уровня СЛЦ согласно классичеcким критериям EBMT (European Group for Blood and Marrow Transplantation) или они не имеют достаточного уровня парапротеинов, определяемых классическими методами (Attaelmannan M, Levinson SS. 2000). Действительно, в большинстве сообщений только небольшое количество больных имеют измеряемый уровень парапротеинов (Kyle RA, Gertz MA, Greipp PR, et al. 1997, Wechalekar AD, Goodman HJ,Lachmann HJ, et al 2007; Dispenzieri A, Lacy MQ, Zeldenrust SR, et al. 2007, Gertz MA, Comenzo R, Falk RH, et al 2005, Dhodapkar MV, Hussein MA, Rasmussen E, et al. 2004, Abraham RS, Katzmann JA, Clark RJ, et al 2003).
Хотя введение измерений СЛЦ предлагается как стандарт для количественной оценки гематологического ответа у больных AAL (Gertz MA, Comenzo R, Falk RH, et al 2005), но все еще имеются трудности в интерпретации результатов, особенно у больных с вовлечением почек или при неизмеряемых абсолютных значениях СЛЦ. Поэтому предлагается оценивать гематологический ответ, используя оба критерия как поведения СЛЦ, так и количественного исследования парапротеина с помощью иммунофиксации (Gertz MA, Comenzo R, Falk RH, et al 2005).
Для больных с тяжело нарушенной функцией почек ответ СЛЦ оценить трудно ввиду ретенции поликлональных легких цепей. Поэтому отношение каппа/лямбда, вероятно, является более надежным маркером, чем концентрация СЛЦ, поскольку не зависит от состояния почечной функции (Lachmann HJ, Gallimore R, Gillmore JD, et al. 2003, Clark RJ, Katzmann JA, Abraham RS, et al 2001, Wechalekar AD, Goodman HJ, Lachmann HJ, et al 2007). Следует отметить, что нормализация каппа/лямбда в ходе интенсивной химиотерапии соответствует положительному прогнозу, и частота выживания возрастает, если амилоидогенные СЛЦ уменьшаются более, чем наполовину после химиотерапии (Lachmann HJ, Gallimore R, Gillmore JD, et al. 2003).
Бета-2-макроглобулин распознан как суррогатный маркер среднемолекулярных уремических токсинов и является ключевым компонентом в генезе связанного с диализом амилоидоза. Несколько исследований оценивали связь бета-2-М с клиническим исходом у диализных больных. Прогностическое значение сывороточного уровня бета-2-М для выживания больных на гемодиализе было исследовано Okuno S, Ishimura E, Kohno K, et al (2009) у 490 обычно диализируемых пациентов (60.1 +/- 11.8 лет, длительность диализа 87.4 +/- 75.7 мес, 288 мужчин и 202 женщин; 24% больных диабетом). Больные были разделены на две группы согласно сывороточному уровню бета-2-М: низкая группа (n = 245) с уровнем <32.2 мг/л (медиана бета2-M в сыворотке) и высокая группа (n = 245) с >или r=32.2 мг/л. За время периода наблюдения 40+/-15 мес 91 больной умер, из них 36 от кардиоваскулярных заболеваний. Анализ Каплана-Мейера обнаружил, что общая летальность в высокой группе оказалась значительно выше, чем в низкой группе ((P < 0.001). Мультивариантный пропорциональный анализ Кокса показал, что сывороточный уровень бета-2-М является значимым предиктором общей летальности (hazard ratio, 1.05; 95% CI, 1.01-1.08; P = 0.005), и несердечной летальности (hazardratio, 1.06; 95% CI, 1.02-1.10; P = 0.006) при уравнивании по возрасту, полу, длительности диализа, наличию диабета, недосточному весу тела, наличию хронического воспаления, сывороточному альбумину и СРБ.
В заключении следует отметить, что парапротеинемии с изолированным синтезом моноклональных свободных легких цепей часто не имеют достаточно высоких концентраций сывороточных легких цепей, чтобы они могли быть обнаружены сывороточным электрофорезом белков, иммунофиксацией или даже иммунохимическими методами. Но для клиницистов важно располагать прижизненным тестом выявления моноклональных гаммапатий, который можно выполнять повторно, результаты которого были бы воспроизводимы и получались бы в пределах нескольких дней. Подкожная жировая ткань, полученная путем аспирации из области живота, исключительно подходит для этих целей, и мазки часто оказываются положительными, будучи окрашены конго рот (Westermark P. 1995). Аспирация подкожного жира является тестом выбора для определения амилоида у больных с подозрительной клинической картиной. Это легкий и недорогой метод с минимальными осложнениями. Он достаточно специфичен, однако, его чувствительность может оказаться ниже, чем опубликовано, что определяется длительностью, формой и распространенностью гаммапатии, применяемой техникой и диагностическим опытом. Перспективно дальнейшее проведение иммуногистохимического анализа выявляемых при этом фибрилл.