Определение осмотической стойкости эритроцитов

Тест на осмотическую стойкость эритроцитов используется для измерения устойчивости эритроцитов к гемолизу при воздействии разных концентраций солевого раствора. Нормальная мембрана эритроцитов не растягивается и практически свободно проницаема для воды. Когда эритроциты подвергаются воздействию гипотонической среды, вода попадает в клетку и приводит к ее лизису. В этот момент мембрана эритроцита разрывается, и гемоглобин выходит в надосадочный раствор. Сфероциты являются осмотически менее стойкими клетками, которые легче лизируются в гипотоническом растворе, по сравнению с нормальными эритроцитами. Следовательно, эти клетки гемолизуются в большей степени, чем нормальные эритроциты при суспендировании в гипотонических растворах хлорида натрия. Тест на осмотическую стойкость эритроцитов представляет собой классический тест для диагностики  наследственного сфероцитоза. 

Классический осмотический тест на осмотическую стойкость, первоначально описанный Parpart et al. (1947), заключается в добавлении цельной крови в серию солевых растворов в диапазоне от 0,1% до 0,9%. Эти образцы подвергают центрифугированию с измерением оптической плотности при 540 нм, чтобы рассчитать процент гемолиза для каждого раствора. Тест на осмотическую стойкость эритроцитов выполняется в свежеприготовленной крови (в течение 2 часов после сбора), а также после инкубации при 37 ° С в течение 24 часов.

Наследственный сфероцитоз (НС) - это хроническая гемолитическая анемия, ассоциированная с различными мутациями, которые приводят к дефектам белков мембран эритроцитов. Морфологическим признаком НС является микросфероцит, который вызван потерей площади поверхности мембраны эритроцитов и имеет аномальную осмотическую стойкость in vitro.  Типичные признаки НС включают гемолитическую анемию легкой и средней степени тяжести, сфероцитоз в мазке периферической крови и эффективность спленэктомии. Клиническая картина НС включает как легкие, так и бессимптомные формы, а также тяжелые формы, которые проявляются при рождении. Ранее сообщавшаяся распространенность НС в западных популяциях, составляющая 1 на 4000 человек, является недооценнной, поскольку более легкие формы данного заболевания могут протекать бессимптомно, что предполагает распространенность 1 на 2000 человек.

Дефект мембран эритроцитов и интактная селезенка, которая избирательно удерживает и повреждает аномальные эритроциты, являются основными патогенетическими факторами данного заболевания. Наследственный дефицит или дисфункция белков мембраны эритроцитов приводит к многоэтапному процессу ускоренного разрушения аномальных эритроцитов. Дестабилизация липидного бислоя способствует высвобождению липидов из мембраны, что приводит к дефициту площади поверхности и образованию плохо деформируемых сфероцитов, которые избирательно удерживаются и повреждаются в селезенке (Рис.1). При НС дефекты белков мембраны эритроцитов приводят к нестабильности эритроциатрного цитоскелета. Потеря площади поверхности эритроцитов приводит к образованию сферических эритроцитов (сфероцитов), которые задерживаются селезенкой. Гемолиз в первую очередь ограничивается селезенкой и, следовательно, является внесосудистым. При данной патологии обычно развивается спленомегалия.  При НС были идентифицированы такие нарушения мембранных белков, как  недостаток спектрина сочетанный дефицит спектрина и анкирина, недостаток белка полосы 3, дефект протеина 4.2.

Как и при других хронических гемолитических состояниях, признаки и симптомы НС включают бледность, периодическую желтуху и спленомегалию. Однако,клиническая картина данного заболевания крайне гетерогенна. Типичный пациент с НС относительно бессимптомен. Как отмечалось в самых ранних описаниях НС, умеренная желтуха может быть единственным симптомом заболевания. Анемия обычно бывает легкой или умеренной, но может отсутствовать из-за компенсаторной гиперплазии костного мозга, проявляющейся ретикулоцитозом. Спленомегалия постепенно развивается у большинства пациентов, причем селезенка иногда достигает больших размеров. Наличие НС выявляется только в результате лабораторных исследований или в результате выявления данной патологии у родственников с более симптоматической формой заболевания. Некоторым пациентам впервые ставят диагноз во время вирусных инфекций, таких как инфекционный мононуклеоз или парвовирусная инфекция, во время беременности или в пожилом возрасте, поскольку способность костного мозга компенсировать гемолиз уменьшается. У пациентов с тяжелыми формами НС развивается тяжелый угрожающий жизни гемолиз на ранних этапах жизни. Некоторые пациенты могут быть зависимыми от переливания крови в раннем младенчестве и детстве. К основным молекулярным дефектам относится серьезный дефицит спектрина или белка полосы 3.

В большинстве случаев НС клинические проявления ограничиваются поражением эритроидного ростка костного мозга. Тем не менее, сообщалось о нескольких родственных НС с косегрегирующими неврологическими или мышечными нарушениями, такими как дегенеративное заболевание спинного мозга, кардиомиопатия или умственная отсталость.

Лабораторная диагностика

У большинства пациентов развивается гемолитическая анемия легкой или умеренной степени тяжестир или вообще отсутствует, так как гемолиз полностью компенсируется увеличением выработки эритроцитов, о чем свидетельствует ретикулоцитоз. Однако некоторые пациенты страдают выраженной анемией, а концентрация гемоглобина составляет от 4 до 6 г/дл.

Несмотря на увеличенный процент ретикулоцитов с большим объемом, чем у зрелых эритроцитов, средний объем эритроцито (MCV) часто снижен, а средняя концентрация гемоглобина в эритроцитарной массе  (MCHC) обычно увеличивается (> 35 г/дл), что отражает умеренную клеточную дегидратацию. Значения MCHC более 35,4 г / дл в сочетании с распределение эритроцитов по величине (RDW) <14% является отличительной особенностью НС. В биохимическом анализе крови выявляются повышенные уровни лактатдегидрогеназы и неконъюгированного билирубина , а также пониженный гаптоглобин. Однако эти нарушения могут отсутствовать у лиц с легкой формой заболевания.

В мазке периферической крови сфероциты определяются как маленькие клетки с интенсивной окраской без обычной для нормальных эритроцитов бледности в центре. При легких формах заболевания мазок периферической крови может  быть нормальным, поскольку потеря площади поверхности может быть слишком маленькой, чтобы оценить ее по оценке мазка крови.

Референсные значения:

Интерпретация результата

• Пониженная осмотическую стойкость эритроцитов характерна для пациентов с наследственным сфероцитозом.   Сфероциты являются осмотически менее стойкими клетками, которые легче лизируются в гипотоническом растворе, по сравнению с нормальными эритроцитами. Тест на осмотическую стойкость после инкубации цельной крови в термостате при t=37° С считается более чувствительным, чем тест на осмотическую стойкость эритроцитов без инкубации. Пониженная осмотическая стойкость также может наблюдаться при других заболеваниях, включая наследственный стоматоцитоз, наследственный пиропойкилоцитоз, врожденную дизэритропоэтическую анемию типа II. Данный феномен также может быть ассоциирован с  аутоиммунной гемолитической анемией, отравлениями, ожогами, состояниями после гемотрансфузии.

• Повышенная осмотическая стойкость эритроцитов указывает на наличие сплющенных эритроцитов (лептоцитов), у которых снижено соотношение площади поверхности к объему. Такое изменение происходит при железодефицитной анемии, талассемии и серповидноклеточной анемии, так как эритроциты с низким содержанием гемоглобина (MCH) и низким средним объемом клеток (MCV) необычайно устойчивы к осмотическому лизису. Ретикулоциты и эритроциты у пациентов после спленэктомии также более осмотически устойчивые по сравнению с нормальными клетками. При заболеваниях печени вследствие пассивного накопления липидов эритроциты также более устойчивы к осмотическому лизису.