Диагностика аутоиммунных заболеваний
В патогенезе аутоиммунных заболеваний (АИЗ) принимают участие все механизмы иммунного ответа, включая врожденные и приобретенные, как гуморальные, так и клеточные. На сегодняшний день клинически значимых методов оценки клеточного иммунного ответа не существует. Выявление аутоантител, т.е. серологические методы, являются основными в диагностике АИЗ.
Целый ряд особенностей отличают методы обнаружения аутоантител от оценки содержания других биологических молекул в биологических жидкостях, поэтому ряд аспектов диагностического использования аутоантител требует отдельного освещения.
Аутоантитела
Аутоантитела представляют собой иммуноглобулины человека классов G, A, M (IgG, IgA, IgM), способные специфически связываться с антигенными эпитопами молекул собственного организма. Появление аутоантител представляет собой нормальный биологический феномен, а связывание иммуноглобулинов с собственными антигенами можно выявить в сыворотке любого человека. В норме существует популяция В-1 (CD5+) клеток, синтезирующая полиреактивные низкоаффинные иммуноглобулины, способные связываться со многими антигенами. Роль аутоантител в норме и причина их появления изучена недостаточно. Вероятно, причиной образования аутоантител является перекрестная реактивность иммуногенных эпитопов между антигенами инфекционных агентов и собственными молекулами организма. Спектр антигенных стимулов, окружающих человека, постоянно меняется, что ведет к образованию низкоаффинных непатогенных аутоантител.
Большинство разновидностей аутоантител сравнительно часто могут быть обнаружены у клинически здоровых лиц. К аутоантителам, которые могут быть случайной находкой у здоровых лиц, относят антинуклеарный фактор (3%), ревматоидный фактор (3%), антитела к тиреопероксидазе (4%), антитела к кардиолипину (1%), антитела к миокарду (5%), антитела к скелетным мышцам (3%).
Встречаемость многих аутоантител нарастает с возрастом, аутоантитела появляются на фоне инфекций, травмы и новообразований, которые не сопровождаются аутоиммунными проявлениями. В этом случае аутоантитела могут нести самостоятельную иммунную функцию, например, участвовать в клиренсе молекул ткани. Однако, титры аутоантител, присутствующих в норме, низки и сравнительно нестойки с течением времени.
Для того, чтобы отличить транзиторную индукцию аутоантител от хронического присутствия аутоантител при АИЗ, может потребоваться повторное обследование. Учитывая, что время полужизни сывороточных иммуноглобулинов составляет около 3-х недель, время между повторными обследованиями должно быть не менее 1-2 месяцев.
Прямое участие аутоантител в развитии патофизиологических процессов, характерных для данного АИЗ, не всегда представляется доказанным. В таком случае принято говорить об аутоантителах как «свидетелях» иммунологических реакций.
Высокое содержание аутоантител не всегда сопровождаться высокой клинической активностью АИЗ. Так ряд больных с СКВ имеют высокие титры аутоантител к дсДНК, однако поражения почек у них нет. Это указывает на то, что ряд характеристик аутоантител, в том числе аффинность, количество, присутствие тканевого воспаления и других реакций иммунной системы крайне важны для проявления патогенетического действия аутоантител. С другой стороны, при АИЗ может наблюдаться ситуация при которой антитела постепенно исчезают из сыворотки по мере развития болезни. Так антитела к островковым клеткам поджелудочной железы у большинства больных сахарным диабетом 1 типа исчезают через 1 год после клинического дебюта заболевания.
Появление аутоантител обычно в высоких титрах на фоне АИЗ указывает на их участие в механизмах аутоиммунной реакции. Для доказательства принципиальной роли аутоантител при АИЗ необходимо соблюдение ряда формальных условий. Так предполагается, что в пораженной ткани можно обнаружить совместно иммунные комплексы аутоантитела и соответствующего аутоантигена. При моделировании заболевания на экспериментальных животных сыворотка из организма больного животного или человека, перенесенная здоровому животному или аутоантитело, полученное иммунизацией аутоантигеном, приводит к изменению структуры и функции, схожим с таковыми при оригинальном АИЗ. Аутоантитело должно оказывать действие на клетки клеточных культур или изолированной ткани ex vivo. И наконец, должна существовать корреляция титров аутоантитела и активности заболевания. Далеко не для всех аутоантител могут быть выполнены все эти требования. Изученные механизмы участия аутоантител в иммунопатогенезе АИЗ приведены в таблице.
Механизмы участия аутоантител в иммунопатогенезе аутоиммунных заболеваний
|
Механизм |
Основные аутоантитела и заболевания |
|---|---|
|
Взаимодействие с белковыми системами крови и других биологических жидкостей |
|
|
Взаимодействие с рецептором (слущивание, блокада или стимуляция) |
|
|
Комплемент – опосредованное разрушение компонентов клеток и и ткани |
|
|
Перекрестное связывание молекул и активация клетки |
|
|
Отложение иммунных комплексов с реактивным воспалением |
|
|
Трансплацентарный перенос с возникновением транзиторной врожденной клиники заболевания |
|
|
Опсонизация, фагоцитоз и изменение клиренса молекул и клеток |
|
Возможность использования конкретной разновидности аутоантител в качестве диагностического показателя определяется их встречаемостью при аутоиммунном заболевании. Встречаемость тех аутоантител, которые используются для клинической диагностики, обычно составляет более 60-70% при патологии и менее 1% в норме и других заболеваниях. Хорошие клинико-лабораторные параметры многих разновидностей аутоантител позволяют рассматривать их в качестве лабораторных маркеров этих заболеваний, то есть высокоспецифичных лабораторных тестов, обладающих исключительной диагностической информативностью.
Чувствительность и специфичность антител
Хотя аутоантитела в большинстве случаев являются надежными маркерами АИЗ и принимают участие в патогенезе АИЗ, однако некоторые их разновидности сравнительно часто могут быть обнаружены у здоровых лиц (см. выше). Поэтому при диагностике аутоиммунных болезней большое значение имеет чувствительность и специфичность конкретного теста.
Чувствительность определяет, как часто антитела встречаются у лиц с заболеванием.
Специфичность, наоборот, определяет насколько редко антитела встречаются при других болезнях.
Так, например, если специфичность равна 90%, то это указывает на то, что каждый 10-й тест будет ложноположительным.
Более чувствительные тесты целесообразно использовать при скрининге (т.е. ранней диагностике) заболеваний, более специфичные - при подтверждении диагноза (т.е. дифференциальной диагностике).
Высокоспецифичными серологическими маркерами называют те разновидности аутоантител, которые встречаются исключительно при этом заболевании. Так к высокоспецифичным серологическим маркерам относят анти-дсДНК и анти-Sm - при СКВ, антитела к Scl-70 антигену при склеродермии. Некоторые аутоантитела могут одновременно быть высокоспецифичными маркерами нескольких групп заболеваний. Например, антитела к цитоплазме нейтрофилов отмечаются как при гранулематозных васкулитах, так и воспалительных заболеваниях кишечника. Ряд аутоантител, характерных для аутоиммунных заболеваний, сравнительно часто отмечаются у нормальных лиц без признаков аутоиммунного заболевания, что значительно ограничивает их диагностическое использование. Так, клиническое использование антител к скелетным мышцам при миастении или антител к миокарду ограничено, так как они часто могут отмечаться в норме либо при неиммунных заболеваниях.
Обычно появление высоких титров специфических аутоантител у клинически здоровых лиц может рассматриваться в качестве фактора риска развития аутоиммунного заболевания. Аутоантитела в сыворотке крови могут обнаруживаться за несколько месяцев до клинических проявлений заболевания. Так при ревматоидном артрите антицитруллиновые антитела могут быть обнаружены за полтора года до дебюта артрита, обнаружение антинейтрофильных антител предваряет развитие гломерулонефрита на несколько месяцев.
Титр аутоантител
Клиническое значение обнаружения аутоантител отчасти зависит от титров содержания аутоантител в сыворотке обследуемого. Обычно высокое содержание антител указывает на высокую аффинность последних. Это, в свою очередь, характеризует специфичность и выраженность иммунного ответа. Обнаружение высоких титров антител обычно указывает на аутоиммунное заболевание, в то время как низкие титры часто отмечаются в норме и не специфичны. В отсутствии иммуносупрессивного лечения при аутоиммунных заболеваниях содержание аутоантител обычно сохраняется высоким длительное время. В случае появления антител на фоне инфекции или неиммунного воспаления титры антител обычно нестойки и подвержены значительным колебаниям.
Клональность иммуноглобулинов
Аутоантитела синтезируются в составе нормального пула иммуноглобулинов сыворотки крови плазмацитами костного мозга, лимфатических узлов и селезенки, однако в ходе иммунного ответа при аутоиммунном процессе продукция антител в очаге воспаления может приобретать особые характеристики, например, может измениться клональность иммуноглобулинов. Так при рассеянном склерозе отмечается выраженное увеличение местного синтеза антител и иммунный ответ в ликворе становится олигоклональным, а при смешанной криоглобулинемии в состав криоглобулинов сыворотки входит моноклональный ревматоидный фактор.
Антитела как маркеры клинического течения заболевания
Хотя большинство аутоантител являются свидетелями аутоиммунного воспаления, и их содержание не коррелируют с активностью заболевания, обнаружение определенных типов аутоантител при ревматических заболеваниях указывает на характерные особенности клинического течения. Так у пациентов, имеющих в сыворотке специфический набор антител, наблюдается особенное течение заболевания, отличное от симптоматики больных, не имеющих этих антител. При СКВ сопровождающейся антителами к Ro/SS-A, гломерулонефрит встречается реже, чем у больных, имеющих высокий титр антител к дсДНК, но имеется определенный риск развития поражений кожи и наклонность к повышенной фоточувствительности. Поэтому определение АНА позволяет врачу предсказать, а иногда и предотвратить развитие осложнений. Динамика титра определенных видов антител в ходе заболевания имеет прогностическое значение. Увеличение концентрации антител к дсДНК предшествует вспышке СКВ, и ранняя патогенетическая терапия может уберечь больного от развития клинических проявлений или уменьшить их остроту, что улучшает прогноз при этом заболевании.
HLA-генотип
Выделение больных с тем или иным типом аутоантител в отдельную, часто клинически гомогенную, группу подтверждается обнаружением определенного HLA генотипа у больных с конкретным типом АНА. Так, например, пациенты с дерматомиозитом, у которых в сыворотке крови обнаруживаются антитела к Jo-1, характеризуются исключительно HLA-DR3 (DRw17) и HLA-DRw52 генотипом. Таким образом, исследование содержания аутоантител и их спектра указывают на особенности функционирования иммунной системы и отражают ее особую предрасположенность к формированию аутоиммунных ответов.
Семейства аутоантител
Благодаря тому, что аутоантитела связываются с молекулами сходной структуры или молекулами в составе одной ткани, клетки, органеллы или молекулярного комплекса их делят на семейства. В большинстве случаев АИЗ, сопровождающиеся аутоантителами одного семейства, имеют сходную клиническую симптоматику и патогенез, но выявление конкретных антигенных специфичностей указывает на особенности в клинической картине и течении аутоиммунных заболеваний. К основным семейства аутоантител относят антинуклеарные антитела (АНА), антитела к цитоплазме нейтрофилов (АНЦА), антифосфолипидные антитела (АФА), антицитруллиновые антитела (АЦА), антимитохондриальные антитела (АМА).
Методы детекции антител
Антитела в лабораториях определяют несколькими методами, прежде всего непрямой иммунофлюоресценцией (нРИФ), методом иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблоттингом. Метод непрямой иммунофлюоресценции является наилучшим для определения антител к нерасворимым тканевым антигенам, кроме того, в одном тесте можно определить антитела к нескольким мишеням, что делает его оптимальным методом для скрининга аутоантител. Если точно охарактеризован антиген, с которым связывают аутоантитела, то используется метод иммуноферментного анализа (ИФА) или иммуноблоттинг (ИБ).
Несмотря на определенные трудности в интерпретации результатов иммунологического обследования, а также большой объем информации, который необходимо принимать во внимание при анализе результатов обследования, информативность иммунологических тестов очень высока. Особенности постановки диагностической задачи и планировании иммунологического обследования приведены в таблице.
Особенности постановки диагностической задачи и планировании иммунологического обследования
|
Задача обследования |
Используемый метод |
|---|---|
|
Скрининг аутоантител при ранней диагностике |
Непрямая иммунофлюоресценция |
|
Дифференциальная диагностика |
Иммуноблот и мультиплексный анализ |
|
Мониторинг эффективности терапии |
Иммуноферментный анализ, иммунохимические методы |
Планирование серологического обследования зависит от клинической задачи, которую требуется решить клиницисту. В свою очередь назначение конкретных тестов зависит от их клинико-лабораторных параметров.
Для скрининга используются тесты, отрицательный результат которых с большой вероятностью позволяет исключить заболевание, т.е. тесты с высокой чувствительностью. Обычно такими параметрами обладают методы, которые позволяют одновременно выявлять антитела к антигенам одного семейства. Так назначение антинуклеарного фактора целесообразно на этапе скрининга ревматических заболеваний, так как обычно диффузные заболевания соединительной ткани сопровождаются выявлением антинуклеарных антител. Отрицательный результат выявления АНФ делает диагноз СКВ или системной склеродермии маловероятным.
Часто уже на этапе скрининга необходимо назначать комбинации тестов, параллельное назначение которых значительно снижает вероятность ошибочного исключения диагноза. Так в диагностике ревматоидного артрита, учитывая низкие клинико-диагностические параметры выявление РФ и антицитруллиновых антител в дебюте этого заболевания, рационально назначать панель тестов, включащую как РФ, так и антицитруллиновые антитела.
Дифференциальная диагностика требует назначения тестов, обладающих большей специфичностью. Так при обнаружении низких титров АНФ, выявление антител к дсДНК, указывает на диагноз СКВ. В той же ситуации обнаружение высокого содержания РФ или антител к цитруллиновым антигенам указывает на ревматоидный артрит. Не менее важен вопрос о результатах тестов, которые находятся в «серой зоне». В случае скринингового теста результат, находящийся в «серой зоне» следует интерпретировать как неспецифический, в то время как у пациента с уже определенным диагнозом тот же результат следует отнести к низкой, но значимой концентрации аутоантител. При решении задач дифференциальной диагностики комбинации тестов делают результат обследования более убедительным. Так диагностика антифосфолипидного синдрома с помощью антифосфолипидных антител должна расширяться за счет параллельного обследования для диагностики СКВ.
Хотя литературных данных, указывающих на необходимость широкого скрининга аутоантител в клинике не много, однако существуют исследования, свидетельствующие, что расширение спектра назначений значительно увеличивает число диагностических находок при аутоиммунных заболеваниях. Среди аутоантител, которые позволили диагностировать аутоиммунное заболевание, лидируют антинуклеарные антитела, которые встречаются при многих аутоиммунных заболеваниях.
По нашему собственному опыту, комбинированное тестирование несомненно улучшает информативность обследования пациентов. Комбинированное тестирование, включающее параллельный скрининг разных аутоиммунных заболеваний, имеющих общие черты, крайне информативно при дифференциальной диагностике «системных» ревматических заболеваний. Такой подход позволяет рекомендовать наборы тестов и комплексные алгоритмы обследования, что, в итоге, приводит к росту числа диагностических находок.
Некоторые практические особенности выявления антител
Каждая разновидность аутоантител, даже направленная к одному антигену, представляет собой поликлональную популяцию антител, представленную молекулами иммуноглобулинов с разными физико-химическими свойствами. Это обусловлено тем, что поликлональные антитела реагируют с разными эпитопами на поверхности молекулы-антигена, причем сила связи каждой молекулы антитела с антигеном (аффинность) различна. Естественно, что в идеале иммунологический лабораторный метод должен выявлять не одну разновидность молекул, как это происходит в большинстве традиционных лабораторных тестов, а целый спектр аутоантител, направленных на разные антигены, причем каждое антитело значительно отличается от других по заряду, молекулярной массе и силе связывания с антигеном, которая зависит от условий реакции. Такого идеального метода не существует.
Еще одной особенностью практического выявления аутоантител, вытекающей из биологической природы этого феномена, является то, что не существует абсолютно корректного подхода к измерению содержания аутоантител. Дело в том, что большинство иммунологических тестов построены на связывании аутоантитела и антигена-мишени. Результат теста зависит как от физической концентрации аутоантител, так и аффинности аутоантитела и антигена. При аутоиммунных заболеваниях, специфические антитела синтезируются в высокой концетрации и, обычно, обладают большой аффинностью. Однако, большая концентрация низкоаффинных аутоантител может дать сигнал более сильный, чем малая концентрация высокоаффинных специфических аутоантител. Так у больных с СКВ, у которых в результате поликлональной активации В-клеток, синтезируется большое количество полиспецифичных антител, наблюдаются ложно-положительные реакции в серологических тестах для обнаружения антител к вирусу гепатита С. В то же время, при волчаночном нефрите с нефротическим синдромом, в результате неселективной протеинурии утрачивается сывороточный IgG. В результате при низком содержании IgG тесты по выявлению аутоантител могут быть ложно-отрицательны. Низкоаффинные антитела, как было указано выше, нередко приводят к ложно-положительным результатам анализов. Обнаружение неспецифического и перекрестного связывания аутоантител в некоторых иммунологических тестах, обнаружение низких титров аутоантител в норме нередко требует выделения «серой зоны» или «зоны сомнительных результатов».
В случае обнаружения невысоких титров аутоантител, которые могут быть обусловлены неспецифическим связывание аутоантител или присутствием специфических серологических маркеров, но в низкой концентрации, интерпретация результата зависит от постановки клинической задачи. Если речь идет об исключении ревматической природы заболевания в дифференциальной диагностики неревматической патологии, то результат может быть интерпретирован как отрицательный. В случае, если тест используется для подтверждения ревматического заболевания у больного с другими клиническими признаками ревматической патологии, результат теста должен рассматриваться как положительный.
Для выявления аутоантител в лаборатории в большинстве случаев используются антигены, отличающиеся от антигенов человеческа происхождения. Так в качестве антиген-содержащего субстрата применяются ткани или очищенные антигены животных, перевиваемые клеточные линии и рекомбинантные белки, полученные на основании человеческих генов в различных системах экспрессии белка. По своей антигенной структуре рекомбинантные антигены значимо отличаются от нативных белков тканей человека. Это обусловлено своей третичной структурой, гликозилированием, а также присутсвием аминокислотных последовательностей для эффективного синтеза белка и его очистки. Поэтому одновременно с «аутоантителами» в иммунологических методах часто выявляются реакции иммуноглобулинов с чужеродными эпитопами.
Более совершенным подходом при выявлении аутоантител является использование модельных «дизайнерских» антигенов, структура которых основана на изучении иммунодоминантных эпитопов аутоантигенов человека. В этом случае они могут сильно отличаться от исходных мишеней. Наиболее революционным примером является создание циклического цитруллинированного пептида для диагностики ревматоидного артрита. Используемый в качестве антигена цитруллиновый пептид, был выбран в ходе скрининга случайных пептидных библиотек, которые не имели ничего общего с исходной последовательность белка филлагрина, изучение которой позволило установить характеристики иммунодоминантного эпитопа антицитруллиновых антител. Для создания тест-системы с все шире используются рекомбинантные модельные белки, аминокислотная последовательность которых состоит из чередования иммунодоминантных эпитопов антигена. В этом случае серологическая реакция иммуноглобулина человека с таким «модельным» исскуственным антигеном уже не является аутоантителом в полном смысле этого слова. В связи с этим, термин «аутоантитело» подразумевает определенную «серологическую реакцию» присущую тому или другому аутоиммунному заболеванию. Результат этой серологической реакции зависит от используемого лабораторного метода, каждый из которых имеет свои особенности и ограничения.