Молекулярно-генетическое профилирование соматических мутаций в опухолевой ткани методом секвенирования следующего поколения (NGS)

Понятие молекулярного профилирования и технологии NGS

Молекулярная диагностика является неотъемлемым компонентом современной клинической онкологии. Молекулярное профилирование опухоли – это лабораторное исследование, которое позволяют детально проанализировать генетические и молекулярные особенности опухоли, чтобы определить её уникальный «портрет». Выявление молекулярных маркеров опухоли позволяет оценить прогноз заболевания и подобрать наиболее эффективное таргетное лечение для каждого конкретного пациента, основываясь на особенностях злокачественного образования.

Под таргетной или молекулярно-ориентированной терапией рака понимается применение противоопухолевых препаратов, созданных для взаимодействия с заранее установленными молекулярными мишенями, имеющими ключевое значение при возникновении и развитии солидного образования. Таргетная прецизионная терапия основывается на результатах анализа ДНК опухоли конкретного больного. Таким образом, определяются показания для терапии моноклональными антителами, ингибиторами тирозинкиназ, иммунотерапии ингибиторами контрольных точек и другой таргетной противоопухолевой терапии.

Разработка и внедрение секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS) представляет собой одно из главных достижений биомедицинской науки последних десятилетий. Суть NGS заключается в многократном прочтении фрагментов ДНК-матрицы. Последующая биоинформатическая обработка позволяет воссоздать исходную последовательность ДНК. Исключительной особенностью секвенирования нового поколения является огромная производительность: стандартное оборудование для NGS позволяет в течение нескольких дней «прочитать» полный геном человека. Многократные прочтения обеспечивают необычайную чувствительность NGS - этот метод позволяет выявлять единичные мутированные копии генов, присутствующие в окружении избытка нормальных последовательностей ДНК, в частности, обнаруживать следовые количества мутированных клеток. Другим преимуществом методики NGS является секвенирование всех кодирующих и некодирующих областей указанных генов и возможность выявлять точечные мутации, небольшие делеции и вставки. Недостатком методики является невозможность выявления протяженных делеций и дупликаций, а также транслокаций и хромосомных аномалий.

Понятие онкогенности при соматических мутациях

На сегодняшний день общепринятой является мутационная теория канцерогенеза, согласно которой причиной возникновения злокачественных опухолей являются мутационные изменения генома клетки. Канцерогенез - многоступенчатый процесс накопления мутаций в различных генах клетки, который приводит к нарушениям ключевых клеточных функций, таких как регуляция пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Результатом является способность опухолевых клеток к бесконтрольному делению, инвазии и метастазированию. Однако не все изменения в геноме клетки могут приводить к ее злокачественному перерождению. Способностью мутаций в соматических клетках (любых клетках организма, кроме половых) приводить к развитию рака называется онкогенность.

Принципиальное значение имеют онкогенные мутации в протоонкогенах, опухолевых супрессорах и генах репарации ДНК.

Протоонкоген — это ген, контролирующий нормальную пролиферацию или дифференцировку клеток, который в результате точечных мутаций, амплификаций, хромосомных перестроек может конститутивно активироваться, превращаться в онкоген и способствовать развитию рака. К протоонкогенам относят EGFR, ERBB2 (HER2), c-KIT, MET, BRAF, KRAS, NRAS, HRAS, PIK3CA и др.

Гены-опухолевые супрессоры (антиоонкогены) функционально противоположны онкогенам и в норме ингибируют деление и рост клеток, а также уход от апоптоза, препятствуя злокачественной трансформации клеток. Их инактивация значительно увеличивает вероятность возникновения злокачественных новообразований. К антионкогенам относятся TP53, PTEN, BRCA1/2, RB1 и др.

Гены репарации ДНК отвечают за исправление ошибок в ДНК клетки. Одноцепочечные и двуцепочечные разрывы в ДНК возникают постоянно, но в норме белки репарации ДНК исправляют эти ошибки. Инактивация генов репарации приводит к тому, что ДНК не может нормально восстанавливать свою непрерывную последовательность, и в ней накапливаются повреждения. Чаще всего данные гены относят к генам-супрессорам опухолевого роста, но иногда их выделяют в отдельную группу. Продукты генов BRCA1 и BRCA2 восстанавливают двухцепочечные разрывы в ДНК путем гомологичной рекомбинации — процесса, при котором поврежденный регион восстанавливается с использованием последовательности сестринской хромосомы в качестве шаблона для репарации. Система репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair system, MMR) включает в себя гены MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1, PMS2 и отвечает за обнаружение и исправление инсерций, делеций и ошибочных нуклеотидов, возникающих в процессе репликации или рекомбинации ДНК.

В зависимости от эффекта соматических мутаций на канцерогенез, выделяют:

1. Драйверные мутации: дают преимущество в росте и развитии несущим их клонам опухолевых клеток.

2. Пассажирские мутации: не оказывают существенного влияния на развитие клонов опухолевых клеток. Такие мутации присутствуют в клетках-предшественницах опухолевых клеток, когда те приобретают драйверные мутации, а потому распространяются среди клонов наравне с драйверными.

При этом драйверные мутации можно функционально разделить на активирующие и инактивирующие.

Активирующие (gain-of-function) мутации приводят к повышенной выработке сигнальных белков. Пример подобных мутаций — замена одной аминокислоты на другую, приводящая к аутофосфорилированию тирозинкиназных белков EGFR или ATM. Аутофосфорилирование способствует стимуляции активности тирозинкиназ и передачи клеточных сигналов к росту и делению.

Инактивирующие (loss-of-function) мутации способствуют снижению или полному подавлению активности генов-онкосупрессоров, таких как RB1, TP53, BCL2, APC и др. Потеря функций онкосупрессоров влечет за собой нарушения в клеточном росте и делении.

Оценка онкогенности соматических мутаций опирается на классификацию онкогенности, утвержденную в совместных рекомендациях Clinical Genome Resource (ClinGen), Cancer Genomics Consortium (CGC) и Variant Interpretation for Cancer Consortium (VICC) 2022 г. Согласно данной классификации, мутации подразделяются на пять категорий:

• онкогенные

• вероятно онкогенные

• неопределенного значения

• вероятно доброкачественные

• доброкачественные

В диагностическом заключении указываются только онкогенные и вероятно онкогенные генетические варианты, поскольку только они требуют принятия клинического решения.

Вариант расценивается как онкогенный:

1) если в экспериментах на клеточных линиях, животных моделях или в функциональных моделях он показал себя онкогенным;

2) на основании in silico алгоритмов прогнозирования;

3) если мутация располагается в «горячих точках» (hotspots). Данные рекомендации используются только для точечных мутаций и небольших делеций/инсерций, их нельзя использовать для транслокаций, дупликаций и делеций.

Классификации мутаций по клиническому использованию

Основными классификациями по клинической релевантности мутаций в настоящее время являются:

• AMP/ASCO/CAP ─ классификация Ассоциации молекулярной патологии США (AMP), Американского общества клинической онкологии (ASCO) и Коллегии американских патологов (CAP)

• ESCAT ─ шкала клинической значимости молекулярных мишеней Европейского общества медицинской онкологии (ESMO)

• RUSSCO ─ категоризация клинически значимых нуклеотидных вариантов с целью выбора оптимальной терапии Российского общества клинической онкологии (RUSSCO).

На сегодняшний момент отсутствует консенсус по поводу того, какие именно классификации по клинической значимости выявленной онкогенной мутации использовать в заключении. Однако, классификация AMP/ASCO/CAP, включающая также диагностическую и прогностическую значимость выявленной мутации, кажется более перспективной с точки зрения рутинного клинического использования.

Классификация AMP/ASCO/CAP применяется для онкогенных и вероятно онкогенных мутаций и включает диагностическую, предиктивную и прогностическую значимость для категорий I и II.  

Категория I. Варианты с высокой клинической значимостью (диагностической, предиктивной, прогностической)

• Уровень доказательности A. Терапия одобрена FDA и включена в профессиональные клинические рекомендации.

• Уровень доказательности B. Исследования с высокой статистической достоверностью и экспертным консенсусом.

Категория II. Варианты с потенциальной клинической значимостью (диагностической, предиктивной, прогностической)

• Уровень доказательности C. Терапия, одобренная FDA для других типов опухолей или методы лечения, находящиеся на стадии клинических исследований. Ограниченное количество опубликованных исследований с небольшой выборкой и частичным консенсусом.

• Уровень доказательности D. Доклинические исследования или отдельные клинические случаи без консенсуса.

Категория III. Варианты с неизвестной клинической значимостью

Варианты со значимой частотой аллелей не обнаружены в общих или специфических субпопуляционных базах данных, либо в пан-раковых или опухолеспецифических базах данных. Нет убедительных опубликованных данных о связи данных вариантов с ЗНО.

Категория IV. Доброкачественные и вероятно доброкачественные варианты

Варианты со значимой частотой аллелей обнаружены в общих или специфических субпопуляционных базах данных, однако нет опубликованных данных о связи с ЗНО.

Шкала клинической значимости молекулярных мишеней ESMO (ESCAT) основывается только на терапевтической значимости выявленных мутаций. Определяет шесть уровней клинической значимости молекулярных мишеней в зависимости от их влияния на тактику ведения пациентов:

• Уровень I: молекулярная мишень может применяться в рутинной клинической практике с рекомендацией конкретного препарата при обнаружении определённой молекулярной аберрации;

• Уровень II: молекулярные мишени находятся в стадии исследования и с высокой вероятностью определяют группу пациентов, которым показана таргетная терапия, однако требуются дополнительные исследования;

• Уровень III: молекулярные мишени, для которых клиническая польза уже доказана при других типах опухолей или для сходных молекулярных мишеней;

• Уровень IV: доклинические данные, свидетельствующие о потенциальной значимости молекулярной мишени.

• Уровень V: целесообразно комбинированное воздействие на молекулярные мишени (монотерапия неэффективна, может быть эффективна только комбинированная терапия)

• Уровень X: отсутствие доказательств в пользу клинической значимости при воздействии на молекулярную мишень.

Целесообразность одновременного выявления большого количества мутаций с помощью NGS

Помимо тестов на наличие одной или нескольких онкогенных мутаций с использованием ПЦР, в последнее время с увеличением количества таргетных препаратов и появления новых данных о прогностической значимости мутаций, становится всё более актуальной комплексная молекулярная диагностика, при которой одновременно исследуется несколько десятков значимых для злокачественного образования генов.

К анализируемым молекулярным событиям при этом относятся как аберрации в отдельных генах, так и некоторые интегральные характеристики опухолевого генома, например, признаки дефицита определённого звена системы репарации ДНК (микросателлитная нестабильность, дефицит гомологичной рекомбинации ДНК). Спектр клинически значимых генетических маркеров продолжает расширяться, а некоторые из них приобретают статус «агностических», т. е. информативных при опухолях любых локализаций (к агностическим маркерам, согласно рекомендациям ESMO, относятся транслокации NTRK1,2,3, транслокации и мутации генов RET и FGFR1/2/3, статус MSI и высокая суммарная мутационная нагрузка).

Учитывая все более широкое применение метода NGS для оценки наличия соматических мутаций при злокачественных образованиях, ESMO сформулировало рекомендации по применению NGS-тестирования в практической онкологии, согласно которым рутинное применение NGS оправдано при метастатическом и распространенном раке. Однако, с увеличением количества таргетируемых и прогностически значимых мутаций, а также с увеличением скорости выполнения NGS тестирования, расширенное молекулярное профилирование все чаще назначается и используется даже на ранних стадиях злокачественных образований.

Предиктивная значимость мутаций и таргетная терапия

Предиктивная значимость мутации — это способность конкретной мутации предсказывать чувствительность или резистентность к определённому лекарственному препарату (таргетной терапии, иммунотерапии и др.).

Таргетная терапия (от англ. target — «мишень») — это вид лекарственной терапии, направленный на конкретные молекулярные мишени в опухолевых клетках или микроокружении опухоли, которые критически важны для их роста и выживания. В отличие от химиотерапии, которая направлена на подавление всех быстро делящихся клеток (и здоровых, и опухолевых), таргетные препараты блокируют специфические белки, гены или пути, характерные для раковых клеток. Поскольку таргетная терапия воздействует на конкретные молекулярные мишени, токсичность у нее чаще всего ниже, чем у химиотерапии. Данный тип терапии может быть назначен только при подтверждении наличия мишени ─ мутации или молекулярного феномена.

Например, наличие мутации V600E (c.1799T>A; p.Val600Glu) при меланоме указывает на чувствительность к ингибиторам BRAF и ингибиторам MEK, а комбинация данных препаратов наиболее эффективна. При колоректальном раке наличие мутации BRAF V600E (c.1799T>A; p.Val600Glu) делает ответ на терапию ингибиторами EGFR крайне маловероятным. Назначение этих препаратов в данном случае не рекомендовано, однако возможно их использование в комбинации с BRAF-ингибиторами.

Другим примером можно назвать случаи HR+ HER2- рака молочной железы, при которых при наличии одной или нескольких аберраций в генах PIK3CA/AKT1/PTEN в случае прогрессии после по крайней мере одного режима терапии ингибиторами ароматазы, при наличии метастазов или рецидива во время или в течение двенадцати месяцев после завершения адъювантной терапии (с терапией анти-CDK4/6 или без неё), показана терапия ингибитором киназ AKT в комбинации с конкурентным антагонистом эстрогеновых рецепторов. При этом опухоли с мутацией AKT1 p.Glu17Lys резистентны к аллостерическим ингибиторам AKT, но чувствительны к АТФ-конкурентным ингибиторам AKT.

Таблица 1. Предиктивная значимость онкогенных мутаций*

*Таблица имеет исключительно справочный характер. Решение о назначении терапии принимается лечащим врачом на основании всего объема клинических и лабораторных данных.

Необходимость повторного выполнения молекулярного профилирования в случае прогрессии/метастазирования опухоли

Серьезным препятствием эффективности молекулярно-ориентированной терапии считается существенная гетерогенность молекулярного профиля разных областей одной и той же опухоли (интратуморальная гетерогенность), а также различие по молекулярной характеристике между первичной опухолью и ее метастазами. Современные исследования показывают, что опухоль значительно видоизменяет свои характеристики в процессе терапии. Эти изменения критически отражаются на спектре лекарственной чувствительности новообразования. Вне зависимости от механизмов резистентности, следует признать, что терапия не может основываться лишь на анализе первичного новообразования — необходимо следить за динамикой свойств опухоли на протяжении всей истории болезни с повторным взятием биопсии в случае прогрессии/метастазирования.

Так, например, точечные мутации ESR1 редко выявляются при первичном раке молочной железы (1 %), при этом их частота при метастатических и прогрессирующих формах рака молочной железы может достигать 10-50 %. В настоящий момент считается, что приобретенные мутации в гене ESR1 являются ведущей причиной вторичной резистентности к гормонотерапии прогрессирующего и метастатического рака молочной железы и выявляются у 25-30% пациенток, которым проводилась терапия ингибиторами ароматазы. Аналогичные механизмы гормональной резистентности могут возникать при раке яичников и раке эндометрия. Согласно рекомендациям ASCO 2023, у пациенток с ER(+) HER2(-) раком молочной железы для определения тактики лечения рекомендовано проводить рутинное тестирование на предмет возникновения мутаций ESR1 при рецидиве или прогрессии (в т.ч. метастазировании), возникших после эндокринной терапии в комбинации с ингибитором CDK4/6 или без него.

Необходимость выявления редких и минорных онкогенных мутаций

Отдельно стоит отметить такое преимущество выявления мутаций методом NGS, как возможность детектировать редкие и минорные онкогенные активирующие мутации. Одним из примеров является определение мутаций в гене PIK3CA, среди которых чаще всего встречаются H1047R (c.3140A>G; p.His1047Arg) – 35%, E545K (c.1633G>A; p.Glu545Lys) – 17%, E542K (c.1624G>A; p.Glu542Lys) – 11%, H1047L (c.3140A>T; p.His1047Leu) – 4%, E545Q (c.1633G>C; p.Glu545Gln). На сегодняшний день выявление онкогенных активирующих мутаций в данном гене является показанием для проведения таргетной терапии. Выявление минорных активирующих мутаций (R88Q, Q546R, K111E, Q546K,  G118D, Q546E, N345K, Q546L, C420R, E726K и другие) также является показанием к назначению ингибиторов PIK3CA и включение их в панель увеличивает на 30% количество пациентов, для которых может быть назначена эта терапия.

В гене KRAS более 80% точечных мутаций локализуются в 12 кодоне (G12D (c.35G>A; p.Gly12Asp), G12R (c.34G>C; p.Gly12Arg), G12C (c.34G>T; p.Gly12Cys), G12V (c.35G>T; p.Gly12Val), G12S (c.34G>A; p.Gly12Ser), G12S (c.34G>A; p.Gly12Ser), G12A (c.35G>C; p.Gly12Ala); G13D (c.38G>A)). Однако редкие замены в кодонах 12, 13, 59, 61, 117, 146 гена KRAS, которые не выявляются рутинными методами, также могут предсказывать резистентность к противоопухолевой терапии.

В гене BRAF наиболее частой является мутация p.Val600Lys, менее частыми являются другие мутации в том же кодоне – p.Val600Arg / p.Val600Met / p.Val600Asp, все они отвечают на терапию ингибиторами BRAF ± MEK. Мутации в кодонах, находящихся рядом p.Val600 в 15 экзоне (в частности, BRAF p.Leu597) и BRAF p.Lys601 и не входящие в «классический» спектр определяемых мутаций, отвечают на терапию ингибиторами MEK и на комбинацию ингибиторов BRAF + MEK.

Что касается мутаций в гене c-KIT, то случаи меланомы с мутациями в экзонах 11 и 13 гена например, p.Trp557Arg, p.Val559Asp, p.Leu576Pro, p.Lys642Glu, обладают высокой чувствительностью к терапии тирозинкиназными ингибиторами. Мутации экзона 17 с-KIT (например, p.Asp816His), обладают минимальной чувствительностью или вообще не имеют чувствительности к ингибиторам тирозинкиназы. Наиболее чувствительным методом детекции данных изменений является метод NGS в связи с низкой доступностью или полным отсутствием ПЦР систем для выявления минорных мутаций.

Другим примером предпочтительного использования NGS при молекулярном профилировании опухоли являются случаи гастроинтестинальных стромальных опухолей, при которых определение типа мутаций в гене c-KIT является одним из основных этапов ведения пациента и назначения терапии. При этом расположение данных мутаций в гене и их тип напрямую влияет на назначение терапии и прогнозирования течения заболевания. Спектр выявляемых мутаций в гене c-KIT характеризуются высоким разнообразием. Несмотря на то, что чаще всего обнаруживаются небольшие делеции и инсерции в экзоне 11, появление любых онкогенных активирующих мутаций в этом гене является показанием к назначению тирозинкиназных ингибиторов. Кроме этого, делеции в 11 экзоне с-KIT ассоциированы с более агрессивным фенотипом, а точечные замены в 11-м экзоне гена c-KIT предсказывают более благоприятный прогноз. Дупликации в 11-м экзоне c-KIT – относительно редкие мутации, они встречаются чаще всего в стромальных опухолях желудка и связаны с благоприятным прогнозом. Мутации в 9-м, 13 и 17 экзоне c-KIT встречаются редко, однако они ассоциированы с высокой степенью злокачественности опухоли и агрессивным фенотипом, что в том числе подчеркивает значимость их выявления.

В гене TP53 80% мутаций локализованы в экзонах 5–8, однако определение остальных изменений в данном гене остается крайне важным этапом прогнозирования течения онкологических заболеваний.

Прогностическая значимость мутаций

Прогностическая значимость мутации — это способность конкретного генетического изменения (мутации) предсказывать течение заболевания, включая агрессивность опухоли, риск рецидива, общую и беспрогрессивную/безрецидивную выживаемость пациента вне зависимости от проводимой терапии. Определение прогноза является важной составляющей комплексного лечения онкологических пациентов. По этой причине правильная оценка вероятностей выживаемости может позволить стратифицировать пациентов по группам риска и определять показания для соответствующих методов лечения. В качестве примеров можно привести прогностическую значимость генов BRAF, TERT, IDH, HER2 при опухолях различной локализации.

Так, например, мутации в генах TP53 или BRAF при многих видах рака ассоциирована с неблагоприятным прогнозом, быстрым метастазированием и снижением выживаемости. Мутация BRAF V600E (c.1799T>A; p.Val600Glu) ассоциирована с агрессивным фенотипом рака щитовидной железы, особенно при наличии ко-мутации в промоторе гена TERT, что повышает риск рецидива. ESMO указывает на ассоциацию мутации BRAF V600E (c.1799T>A; p.Val600Glu) с агрессивными гистологическим фенотипом, а именно метастазами в лимфатические узлы и экстратиреоидным распространением. В сочетании мутации BRAF V600E (c.1799T>A; p.Val600Glu) и TERT имеют сильное синергетическое влияние на агрессивность папиллярного рака щитовидной железы, увеличение риска рецидива и смертности пациентов, тогда как при отдельном выявлении мутаций оно существенно меньше.

Другим примером является прогностическая значимость мутаций в гене BRAF при колоректальном раке. Согласно данным NССN, наличие мутаций в гене BRAF связано с агрессивным фенотипом опухоли. Ряд международных исследований подтвердил снижение общей и беспрогрессивной выживаемости у пациентов с метастатическим колоректальным раком с мутацией BRAF (медиана выживаемости меньше на 10-16 месяцев независимо от варианта терапии). Мутации BRAF не-V600E (p.Val600Glu) определяют отдельный молекулярный подтип метастатического колоректального рака с благоприятным прогнозом. Случаи немелкоклеточного рака легкого c мутацией BRAF p.Val600Glu ассоциированы с агрессивным фенотипом опухоли и имеют более низкую общую выживаемость в сравнение с опухолями без мутаций в гене BRAF.

Наличие или отсутствие мутаций в гене IDH и ко-делеции 1p/19q является основополагающим принципом в классификации опухолей центральной нервной системы ВОЗ 2021 г. В соответствии с этой классификацией опухоли подразделяются на: 1) астроцитому с мутацией в генах IDH (Grade 2–4); 2)     олигодендроглиому с мутацией в генах IDH и ко-делецией 1p/19q (Grade 2–3); 3) глиобластому без мутаций в генах IDH. Присутствие в опухоли мутаций в генах IDH является ключевым диагностическим признаком для диффузных глиом Grade 2-4 у взрослых и вторичных глиобластом. Глиомы Grade 1 не несут мутаций в генах IDH. Наличие мутации в генах IDH ассоциировано с благоприятным прогнозом независимо от возраста (выше общая и беспрогрессивная выживаемость). На сегодняшний день известно, что показатели общей выживаемости у пациентов с глиобластомами позитивными на мутации в генах IDH в 2 раза превышают таковые у пациентов без мутаций.

Согласно данным NCCN и ESMO, HER2-позитивный рак молочной железы является одной из наиболее агрессивных разновидностей заболевания, которая характеризуется быстрым темпом роста опухоли, высоким риском развития рецидива и появления отдаленных метастазов, нередко, в головном мозге. Согласно данным ESMO, амплификация HER2 у пациентов с раком желудка коррелирует с агрессивным фенотипом и снижением общей выживаемости.

Первичная и вторичная резистентность опухолей к таргетной терапии

Большой проблемой в онкологии являются развитие первичной и вторичной (приобретенная) резистентность к противоопухолевой, в т.ч. таргетной терапии.

Первичная резистентность к противоопухолевой терапии — это устойчивость опухоли к лечению, которая присутствует еще до воздействия препарата на клетки. Она обусловлена гетерогенностью опухоли и наличием в ней клеток, которые изначально нечувствительны к действию лекарственного препарата из-за своих генетических особенностей или наличия обходных путей метаболизма. Это приводит к тому, что у части пациентов данная противоопухолевая терапия оказывает минимальный эффект, либо эффект полностью отсутствует.

Вторичная резистентность к противоопухолевой терапии — это развитие устойчивости опухолевых клеток к лечению после первоначального ответа, когда терапия перестает быть эффективной и приводит к прогрессии заболевания. Это происходит из-за естественного отбора наиболее устойчивых клеток в опухоли, в т.ч. из-за приобретения новых мутаций и клональной селекции, что позволяют клеткам опухоли противостоять воздействию препаратов.

Так, мутации в гене EGFR могут быть первичными и вторичными (приобретенными) по отношению к анти-EGFR терапии. У 20-30% пациентов с немелкоклеточным раком легкого с мутациями в гене EGFR развивается резистентность к противоопухолевой терапии. Причиной развития резистентности могут быть мутации в самом гене EGFR или сопутствующие мутации в других онкогенах. Причиной около 50-60% вторичной резистентности к тирозинкиназным ингибиторам EGFR является мутация p.Thr790Met в 20-м экзоне гена EGFR. Инсерции в 20 экзоне гена EGFR встречаются лишь в 3% опухолей с мутациями и тоже определяют резистентность. Наличие мутации p.Thr790Met служит показанием для назначения ингибиторов тирозинкиназы EGFR 3-го поколения. Не все инсерции 20 экзона обуславливают резистентность к ингибиторам тирозинкиназ: например, инсерции p.A763_Y764insFQEA и p.A763_Y764insLQEA являются чувствительными к данной терапии.

Вторичная резистентность к тирозинкиназным ингибиторам ALK при немелкоклеточном раке легкого в 20–37% случаев обусловлена вторичными мутациями и амплификациями в гене ALK, которые возникают уже при наличии транслокаций ALK. Наиболее частыми из точечных мутаций являются p.Leu1196Met и p.Gly1269Ala. После того, как ингибиторы ALK первого поколения продемонстрировали резистентность при немелкоклеточном раке легкого, многие исследования показали, что ингибиторы ALK второго поколения могут быть более эффективны, и по эффективности превосходят химиотерапию. Следует отметить, что тирозинкиназные ингибиторы ALK второго поколения в настоящее время являются предпочтительной терапией согласно рекомендациям ESMO, в то время как ингибитор ALK третьего поколения также рекомендован FDA и NCCN в качестве начальной терапии и дополнительного предпочтительного препарата первой линии. Высокорезистентная мутация p.Gly1202Arg выявляется менее чем в 10% случаев развития резистентности к ингибитору ALK первого поколения и является наиболее распространенной причиной вторичной резистентности к ингибиторам ALK второго поколения, встречающейся у 21-43% пациентов, получавших лечение ингибиторами ALK второго поколения. Другие мутации, определяющие резистентность к ингибиторам ALK второго поколения - p.Ile1171Asn, p.Phe1174Val, p.Thr1151Lys, p.Thr1151Arg, p.Asp1203Asn, p.Glu1201Lys (у разных мутаций различный спектр резистентности/чувствительности к различным ингибиторам ALK второго поколения). Ингибитор ALK третьего поколения эффективен при многих резистентных к предыдущим поколениям препаратов мутациям, в том числе p.Gly1202Arg, p.Leu1196Met и p.Gly1269Ala. Сложные мутации ALK, резистентные к ингибитору ALK третьего поколения, включают p.Leu1196Met/p.Asp1203Asn, p.Leu1196Met/p.Gly1202Arg, p.Phe1174Leu/ p.Gly1202Arg и p.Cys1156Tyr/p.Gly1269Ala. Некоторые сложные мутации, которые вызывают резистентность к ингибитору ALK третьего поколения, приводят к восстановлению чувствительности к ингибиторам ALK первого или второго поколения.

Феномен ко-мутаций и влияние на лечение и прогноз

Ко-мутации - это наличие нескольких мутаций в генах опухолевой клетки, которые могут влиять на ее рост, метастазирование и ответ на лечение. Эти мутации способны как синергически усиливать друг друга, так и противодействовать друг другу (значительно реже), что усложняет прогнозирование и выбор терапии.

Наличие определенных ко-мутаций может изменять чувствительность опухоли к конкретным противоопухолевым препаратам, определять резистентность к терапии, необходимость комбинированного подхода, определять прогностическое значение. Ранее считалось, что сосуществование нескольких мутаций встречается крайне редко, однако на сегодняшний момент показано, что от 5% до 50% случаев солидных злокачественных образований характеризуются данным феноменом. Ко-мутации могут вызывать первичную и вторичную резистентность к таргетной и иммунотерапии.

В качестве примера данного феномена можно привести проблему ко-мутаций при раке легкого. При немелкоклеточном раке легкого с мутацией в гене EGFR ко-мутации TP53 и PIK3CA являются частой причиной приобретенной резистентности к тирозинкиназным ингибиторам EGFR. У пациентов в данных группах снижена общая и беспрогрессивная выживаемость. Различные ко-мутации PIK3CA по-разному влияют на прогноз у пациентов с немелкоклеточным раком легкого с мутацией EGFR, получающих терапию тирозинкиназными ингибиторами EGFR. Мутации p85-связывающего домена (p.Arg88Gln, p.Arg108His и p.Lys111EGlu) ассоциированы с более высокими показателями беспрогрессивной выживаемости, в то время как мутации в киназном (p.Tyr1021His и p.Tyr1047Arg), хеликазном (p.Glu542Lys) и C2-домене (p.Asn345Lys), ассоциированы с низкими показателями беспрогрессивной выживаемости. Сочетанная амплификация MET вызывает резистентность к тирозинкиназным ингибиторам EGFR в 5–21% случаев после терапии данными препаратами в первой и второй линии. Точечные ко-мутации PTEN, IDH1, KRAS, амплификации MET ассоциированы со снижением общей выживаемости у пациентов с немелкоклеточным раком легкого с мутацией EGFR, получающих терапию тирозинкиназными ингибиторами EGFR. Ко-мутация NRAS p.Gln61Lys может быть причиной резистентности к ингибитору тирозинкиназы EGFR 3-го поколения у пациентов с мутациями в гене EGFR при немелкоклеточном раке легкого.

При наличии мутаций в гене TP53, наиболее часто ко-мутации встречаются в генах EGFR, KRAS, PIK3CA, PTEN. Мутации TP53 являются наиболее частыми ко-мутациями у больных с EGFR-мутированным немелкоклеточным раком легкого (55–65% случаев). У этих пациентов зачастую развивается резистентность к тирозинкиназным ингибиторам EGFR, чаще всего это происходит при мутациях в экзоне 8 гена TP53. Также мутации TP53 могут свидетельствовать о первичной резистентности к тирозинкиназным ингибиторам EGFR при немелкоклеточном раке легкого. Наличие ко-мутаций TP53 может привести к трансформации немелкоклеточного рака легкого в мелкоклеточную карциному после терапии ингибиторами EGFR. Ко-мутация TP53 является негативным прогностическим фактором у пациентов с прогрессирующим немелкоклеточным раком легкого, получающих терапию тирозинкиназными ингибиторами EGFR или ALK. Ко-мутации TP53 и PIK3CA являются частой причиной приобретенной резистентности к тирозинкиназным ингибиторам EGFR всех поколений при немелкоклеточном раке легкого с мутацией в гене EGFR, у пациентов с данной ко-мутацией снижена общая и беспрогрессивная выживаемость. При немелкоклеточном раке легкого с мутациями KRAS ко-мутации TP53 встречаются в 39-42% случаев и ассоциированы со снижением общей выживаемости. Наличие ко-мутаций KRAS и TP53 при немелкоклеточном раке легкого является предиктором чувствительности к иммунотерапии ингибиторами контрольных точек, ко-мутация TP53 ассоциирована с экспрессией PD-L1 ≥50%.

При раке молочной железы частота ко-мутаций TP53 выше при HR(-) HER2(+) варианте. Мутации TP53 могут использоваться как маркер резистентности к анти-HER2 антителам у HER2 (+) пациентов и как маркер резистентности к тирозинкиназным ингибиторам HER2 у HER2(-) пациентов с мутациями в HER2. При раке молочной железы частота ко-мутаций PIK3CA и TP53 составляет 12,8%. Данное сочетание мутаций ассоциировано со снижением беспрогрессивной выживаемости. Ко-мутация TP53 приводит к снижению чувствительности к ингибиторам PI3K при PIK3CA-мутированном ER(+) HER2(-) раке молочной железы. Сочетание мутаций в генах PIK3CA и TP53 является самой распространенной ко-мутацией при глиобластоме, плоскоклеточной карциноме головы и шеи, плоскоклеточной карциноме легкого, саркоме, кожной меланоме, карциноме и карциносаркоме тела матки. В большинстве случаев наличие данной ко-мутации ассоциировано со снижением общей выживаемости. Ко-мутация PIK3CA и TP53 коррелирует со снижением общей выживаемости у пациентов со II/III стадией колоректального рака, получавших терапию 5-фторурацилом. Сочетание мутации в гене TP53 с ко-мутацией HRAS или PIK3CA ассоциировано с неблагоприятным прогнозом при плоскоклеточном раке вульвы.

Определение микросателлитной нестабильности с помощью NGS

Микросателлитной нестабильностью (MSI) называется феномен накопления мутаций в коротких повторяющихся последовательностях ДНК – микросателлитах. MSI представляет собой молекулярный фенотип дефектной системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (dMMR), приводящий к повышенной частоте возникновения мутаций в геноме и являющийся критически важным шагом в злокачественной трансформации. Если мутации возникают в кодирующих регионах, они приводят к мутациям сдвига рамки считывания, что становится причиной синтеза нефункциональных белков. Они формируют неоэпитопы, которые представляются молекулами MHC I класса на поверхности опухолевых клеток (опухолеспецифические неоантигены). Это обусловливает высокую иммуногенность опухолей с MSI и эффективность применения ингибиторов контрольных точек иммунного ответа. Принято разделять опухоли в зависимости от статуса микросателлитной нестабильности на группу MSI (микросателлитная нестабильность) и группу MSS (микросателлитная стабильность). Оценка микростателлитной нестабильности в данном тесте проводится с использованием метода NGS. При выявление молекулярно-генетическими методами (фрагментный анализ, NGS, ПЦР) данный феномен записывается как MSI, при его выявлении иммуногистохимическим методом – краткой записью dMMR.
По данным литературы, dMMR/MSI встречается в ≤5% опухолей. MSI выявляется в 90% случаев синдром Линча (наследственный неполипозный рак толстой кишки), 10-15% спорадических случаев колоректального рака, 5-28% случаев рака желудка, 20-30% случаев рака эндометрия (2% ассоциированы с синдромом Линча), 8-17% случаев рака яичников (3% ассоциированы с синдромом Линча), 1-2% рака поджелудочной железы, 1-2% случаев уротелиального рака.

Опухоли с MSI представляют собой особый подтип злокачественных новообразований, характеризующийся высокой чувствительностью к ингибиторам контрольных точек иммунного ответа. Согласно рекомендациям FDA, иммунотерапия ингибиторами контрольных точек показана пациентам с метастатическим поражением с MSI вне зависимости от локализации злокачественного новообразования. Отсутствие MSI не свидетельствует об отсутствии эффективности применения иммунотерапии у пациентов с метастатическим заболеванием. Также существуют соответствующие рекомендации для отдельных типов опухолей.

Согласно рекомендациям NCCN, определение MSI/MMR показано всем пациентам с вновь диагностированным колоректальным раком, раком желудка, раком пищевода для определения тактики лечения. Международное общество гинекологической патологии (ISGYP) рекомендует определение статуса MSI во всех случаях рака эндометрия. При раке яичников исследование уровня микросателлитной нестабильности включено в рекомендации NCCN и ESMO. Согласно рекомендациям МЗ РФ и RUSSCO, при эндометриоидном, муцинозном и светлоклеточном раке яичников показано определение MSI в биопсийном (операционном) материале для определения показаний к иммунотерапии. Согласно рекомендациям МЗ РФ, всем пациентам с метастатическим раком поджелудочной железы, рекомендуется молекулярно-генетическое исследование, включающее определение MSI в биопсийном (операционном) материале.

Отдельно стоит остановиться на обоснованности применения таких методик как иммуногистохимия (ИГХ), ПЦР и NGS для выявляения MSI.

Согласно рекомендациям Американского общества клинической онкологии (ASCO) и Коллегии американских патологов (CAP) 2022 г:

• У пациентов с колоректальным раком предпочтительным является ИГХ и/или ПЦР, также может быть использован NGS

• У пациентов с раком желудка, пищевода и тонкой кишки рекомендованы ИГХ и/или ПЦР вместо NGS (кроме плоскоклеточной карциномы пищевода)

• У пациентов с раком эндометрия рекомендовано ИГХ вместо ПЦР или NGS

• Возможно использование любого из методов (ПЦР, ИГХ, NGS) для карцином желудочно-кишечного тракта

• В отношении других разновидностей новообразований предпочтительным считается применение либо NGS, либо ИГХ

• ПЦР с последующим гель-электрофорезом ДНК-фрагментов допустим, если учтены особенности детекции MSI в неколоректальных опухолях, а также используются расширенные панели маркеров, а специалист и уверенно детектирует минимальные изменения длины микросателлитов

Заключение:

Секвенирование нового поколения (NGS) – высокопроизводительный и высокочувствительный метод, позволяющий максимально точно на сегодняшний день оценить мутационный профиль опухоли, на основании чего может быть подобрана персонализированная прецизионная таргетная терапия. Решение о назначении терапии принимается только лечащим врачом на основании всего объема клинических и лабораторных данных.