МНОЖЕСТВЕННАЯ МИЕЛОМА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Множественная миелома (ММ) представляет из себя злокачественную плазмоклеточную дискразию, морфологическим субстратом которой являются аномальные плазматические клетки, обнаруживаемые в костном мозге и в большинстве случаев продуцирующие тяжелые цепи моноклонального иммуноглобулина (М-протеина) или легкие цепи.

Впервые обнаружение М-белка в крови у пациентов в бессимптомном периоде было описано в 1960 году профессором Вальденстрёмом, который определили это состояние как «эссенциальная гипергаммаглобулинемия» [28]. Позднее Кайл заметил, что пациенты с моноклональной гаммопатией имеют более высокий риск развития злокачественных опухолей плазматических клеток, в первую очередь множественной миеломы, и, таким образом, пришел к выводу, что эта гаммопатия не всегда была доброкачественной. В связи с чем был введен термин моноклональной гаммопатии неопределенного значения (MGUS) [29]. Далее Landgren et al. провел исследования образцов сывороток в динамике и выявил, что MGUS всегда предшествует множественной миеломе [30].

ММ является гематологическим злокачественным заболеванием, от которого ежегодно умирает более 100 000 человек во всем мире. Средиопухолей кроветворной и лимфоидной тканей насчитывают 10 - 15% случаев, а среди других злокачественных заболеваний 1 - 2% случаев. Чаще всего ММ встречается у пожилых людей; средний возраст постановки диагноза составляет 60–70 лет, распространенность заболевания среди населения моложе 40 лет не превышает 2 % [1].

Ежегодно в США выявляется более 32 000 новых случаев заболевания, и почти 13 000 пациентов умирают от этого заболевания [26]. Множественная миелома немного чаще встречается у мужчин, чем у женщин, и в два раза чаще встречается у афроамериканцев по сравнению с европейцами [27].

ММ характеризуется пролиферацией одного клона плазматических клеток, которые продуцируют моноклональный белок. Ключевым моментом в патогенезе ММ является инициальная мутация, которая возникает, когда В-клетки находятся в процессе созревания в зародышевом центре лимфатических узлов, откуда клоны плазматических клеток мигрируют «нишу» костного мозга (КМ) [2].

Микроокружение КМ играет немаловажную роль в патогенезе ММ, именно оно отвечает за пролиферацию, апоптоз, миграцию атипичных клеток и развитие устойчивости к терапии. В свою очередь, клетки MM нарушают нормальный гомеостаз КМ, что приводит к разрушению костей, активации ангиогенеза, иммуносупрессии и нарушению гемопоэза. Более подробное изучение взаимодействий между клетками микроокружения КМ и MM необходимо для полного понимания инициации и развития заболевания [13].

ММ является прогрессирующим заболеванием, которое последовательно проходит четыре стадии: бессимптомная, называемая моноклональной гаммопатией неопределенного значения (MGUS), тлеющая миелома (SMM), симптоматическая ММ и агрессивная экстрамедуллярная ММ.

Нестабильность генома играет ведущую роль в патогенезе ММ, включая в себя транслокации, аномалии числа хромосом, а также многочисленные соматические мутации.

"Первичные" генетические события

• Транслокации IgH

Соматическая гипермутация и рекомбинация с переключением классов – это дваключевых события в развития злокачественных B-клеток. Во время процесса созревания В-лимфоцитов в зародышевом центре лимфатических узлов происходит генетическое редактирование в гене тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) для повышения аффинности антитела. Наблюдается перестройка гипервариабельной области (V-D-J) - соматическая гипермутация. Позже клетка подвергается рекомбинации с переключением классов, в результате чего образуются антитела разных изотипов. Как соматическая гипермутация, так и рекомбинация с переключением классов приводят к двухцепочечным разрывам ДНК в локусе иммуноглобулина (14q32) и требуют экспрессии AID (activation induced (cytidine) deaminase- фермент — цитидин-дезаминаза, индуцируемая активацией). Несмотря на строгие механизмы контроля, это генетическое редактирование может привести к аберрантному соединению и, следовательно, к хромосомным транслокациям [12, 21].

Наиболее частыми транслокациями IgH при ММ являются t (4; 14), t (6; 14), t (11; 14), t (14; 16) и t (14; 20).

Транслокация (11; 14)чаще всего обнаруживается у пациентов. Данное изменение можно найти в 15 – 20 % случаев. Транслокация приводит к активации CCND1 и стимулированию клеточного цикла. С точки зрения прогноза имеются неоднозначные сведения, что t (11; 14) при ММ занимает нейтральное положение, однако, комбинация транслокации t (11; 14) и мутации CCND1 приводит ухудшению прогноза. [4, 21].

Транслокация t (4; 14)наблюдается примерно у 15% пациентов с MM и связана с неблагоприятным прогнозом. В результате этого события наблюдается сопоставление генов MMSET и FGFR3 из хромосомы 4p16 с энхансерами IgH, в результате чего происходит сверхэкспрессия этих генов. Точка разрыва на хромосоме 4 попадает между двумя генами, и MMSET остается на der (4), а FGFR3 (рецептор 3 фактора роста фибробластов) перемещается в der (14). MMSET представляет собой белок метилтрансферазы, активация которого приводит к усилению метилирования гистона H3K36, таким образом модулируя экспрессию нескольких генов. MMSET также регулирует метилирование гистона H4K20, впоследствии влияя на рекрутирование p53-связывающего белка 1 (53BP1) в месте повреждения ДНК. FGFR3 в свою очередь представляет собой рецептор тирозинкиназы, который активируется онкогенными мутациями. Следует отметить, что FGFR3 мутации выявляются у 17% пациентов с t (4; 14) и, вероятно, являются результатом соматических гипермутаций на der (14). Интересно, что, несмотря на плохой прогноз, связанный с t (4; 14), раннее лечение этих пациентов ингибитором протеасом бортезомибом приводит к улучшению выживаемости, что требует будущих исследований по применению ингибиторов протеасом для лечения пациентов с ММ [12, 18].

Транслокация (6; 14)присутствует у 1-2% пациентов с MM, приводит к сопоставлению CCND3 с энхансерами IGH и, следовательно, к прямому усилению экспрессии CCND3. Общее прогностическое значение этой транслокации нейтрально.

Транслокации t (14; 16) и t (14; 20) являются наиболее редкимииз пяти основных транслокаций – 5% и 1% случаев.  Они влияют на протонкоген c-MAF и онкоген MAFB, соответственно, и приводят к их сверхэкспрессии. Они, в свою очередь, влияют на CCND2, который также способствует пролиферации, влияя на регуляцию фаз G1 / S клеточного цикла. С точки зрения прогноза данные транслокации связаны с плохим исходом [18].

• Гипердиплоидия

Пациенты с гипердиплоидией имеют увеличение нечетного числа хромосом, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 и 21, а клетки в свою очередь содержат в общей сложности от 48 до 75 хромосом. Механизм возникновения такой аномалии пока неясен. Однако основная гипотеза заключается в том, что увеличение числа хромосом происходят во время одного неудачного митоза, а не за счет последовательного прироста одной хромосомы за раз [12]. Пациенты с гипердиплоидией представляют собой неоднородную группу, но в целом они имеют прогноз лучше, чем пациентами с транслокациями IgH. Помимо увеличения нечетного числа хромосом у этих пациентов часто возникают дополнительные транслокации в качестве вторичных генетических событий.

Вторичные генетические события

В дополнение к "первичным" генетическим событиям, описанным выше, проявление миеломы регулярно сопровождается другими аномалиями, которые обеспечивают прогрессию заболевания. Наиболее распространенными являются изменения, затрагивающие целые плечи хромосом: del1p, + 1q, del17p, транслокации и амплификации, включая локус MYC на 8q24, а также точечные мутации, которые в дальнейшем тоже могут рассматриваться как молекулярно-генетические маркеры.

• Делеция 1p.

Делеция короткого плеча 1 хромосомы встречается примерно у 30 % пациентов. С точки зрения прогноза она выступает неблагоприятным маркером. Наибольший интерес в данном генетическом событии вызывает делеция двух областей -  1p12 и 1p32. 1p12 содержит ген-супрессор опухолей FAM46C, функция которого важна для трансляции белка. 1p32 в свою очередь содержит CDKN2C и FAF1. CDKN2C подавляет клеточный цикл и сохраняет клетку в фазе G1. Таким образом, делеция CDKN2C приводит к более быстрому протеканию цикла. FAF1 кодирует белок, участвующий в инициации и стимулировании апоптоза [12].

• Дупликация 1q

Дупликация длинного плеча хромосомы 1 встречается примерно у 25-40% пациентов с MM и оказывает неблагоприятное влияние на общую выживаемость с точки зрения прогноза. Механизм, лежащий в основе данной аномалии, как полагают, включает в себя нестабильность перицентромерной области 1q12 и «прыгающие» транслокации всего плеча 1q, что может быть связано со специфическим гипометилированием перицентромерной области 1q12 и, следовательно, с сильно деконденсированным перицентромерным гетерохроматином [17]. Важно отметить, что количество копий 1q прямо пропорционально клиническому исходу: пациенты, обладающие по меньшей мере четырьмя копиями 1q, имеют менее благоприятный прогноз, чем у пациентов с меньшим количеством копий [21]. 

• Делеция 13q

Делеция длинного плеча хромосомы 13 присутствует примерно у 35-50% пациентов с ММ. Примерно у 85% пациентов эта аномалия затрагивает все длинное плечо, а у остальных 15 % присутствуют различные интерстинальные делеции [7].  Минимально удаленная область находится между 13q14.11–13q14.3 и содержит 68 генов, включая RB1, EBPL, RNASEH2B, RCBTB2 и микроРНК mir-16-1 и mir-15a. Исторически del 13q ассоциировалась с плохим прогнозом; однако большинство пациентов с 13q также имеют транслокации t (4; 14). Следовательно, в настоящее время не очевидно, имеет ли del13q прогностическое значение, независимое от транслокаций t (4; 14) [12].

• Делеция 17p

Делеция 17p наблюдаются примерно у 10% пациентов с впервые диагностированной MM, частота, которая увеличивается до 80% на более поздних стадиях болезни [20].  Большинство подобных аномалий затрагивает все плечо 17 хромосомы и является гемизиготными.  Потеря данной области приводит к утрате гена-супрессора опухолей ТР53, который функционирует как регулятор транскрипции, влияющий на остановку клеточного цикла, репарацию ДНК и апоптоз в ответ на повреждение ДНК [8].  По данным исследований,делеция 17p связана с неблагоприятным прогнозом и способствует прогрессии заболевания в агрессивную экстрамедуллярную ММ.

Точечные мутация

• Гены семейства RAS

Гены семейства RAS — наиболее часто мутирующие гены при ММ. Частота встречаемости составляет 23 - 25 %. Были выявлены активирующие миссенс мутации в генах N-RAS и К-RAS, которые изменяют свойства соответствующих белков и превращают протоонкогены в онкогены. Функциональная нагрузка таких мутаций заключается в том, что белки RAS теряют ГТФазную активность, вследствие чего нарушается их нормальная регуляция цитокинами в передаче митоген-активирующего сигнала к ядру, что приводит к повышенной пролиферации клеток. Стадия, предшествующая ММ, моноклональная гаммапатия неясного генеза (МГНГ), на молекулярном уровне отличается от ММ отсутствием мутаций в генах семейства RAS. По одним данным, они считаются фактором неблагоприятного прогноза, ассоциируются с прогрессией заболевания и меньшей общей выживаемостью, по другим — могут влиять только на резистентность к терапии определенными препаратами (например, бортезомибом) [4, 11].

• Ген BRAF

Частота мутаций в гене BRAF при ММ варьирует от 4 до 14,9 %. BRAF кодирует серин/треониновую протеинкиназу, которая регулирует путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), который участвует в пролиферации, дифференцировке и выживании клеток. Киназа BRAF передает сигнал от RAS белков к нижестоящим эффекторным белкам сигнального пути МАРК [16]. Чаще всего встречается активирующая мутация в 600-м кодоне с заменой валина на глютаминовую кислоту (V600E). Показано, что эта мутация ассоциируется с клинически более агрессивным течением ММ, более низкими показателями общей выживаемости, а также с высокой частотой (>50 %) выявления экстрамедуллярных очагов. [19].

• Ген TP53

Инактивация белка p53 считается универсальным изменением в опухолевой клетке и встречается в 50–60 % новообразований. Опухолевый супрессор p53 является транскрипционным фактором. Этот белок связывается с промоторами различных генов и может как активировать, так и ингибировать их транскрипцию. В основном генные нарушения встречаются в гетерозиготном состоянии, представлены миссенс-мутациями, приводящими к аминокислотным заменам, и затрагивают чаще всего ДНК-связывающий домен. В результате подобных мутаций происходит изменение вторичной структуры белка и появление новых свойств, таких как способность активировать экспрессию некоторых генов, к которым относятся с-MYC, CCND1, MRD1.

Нередко мутации гена TP53 сопровождается описанной выше делецией короткого плеча хромосомы 17 (p17del), что приводит к полной утрате одной копии гена. Другими словами, del (17p) предрасполагает к двуаллельной потере TP53 путем отбора клеток с мутацией TP53. Сочетание мутаций TP53 с потерей 17p приводит к чрезвычайно плохим результатам и является маркером плохого исхода, а также геномной нестабильности.

В отличие от нескольких других прогностических маркеров,статус TP53, как маркера высокого риска, не уменьшился перед лицом современных методов лечения, нацеленных на биологию плазматических клеток [8].

Рекомендации по молекулярному генотипированию ММ

В клинических рекомендации NCCN в качестве дополнительных методов диагностики всем пациентам с впервые выявленной ММ, а также при 1 и 2-м рецидивах рекомендуется проводить цитогенетическое исследование. Необходимость заключается в выявления наиболее важных неблагоприятных молекулярно-генетических маркеров, описанных выше: t(4;14), t(11;14), t(14;16), t(6;14), del 17p13, t(11;14), del 13, плоидность и изменения хромосомы 1 [23].

В клинических рекомендациях ESMO европейские эксперты предлагают в дебюте заболевания выполнять всем пациентам исследования на аберрации t(4;14), t(14;16) и del(17p). При обнаружении любой из указанных аберраций пациент определяется в группу высокого цитогенетического риска, а все остальные случаи — это стандартный риск [24].

Прогностическое и терапевтическое значение молекулярно-генетических маркеров

Исследования последних лет показали, насколько важно выявление и понимание генетических аномалий для оценки прогноза заболевания, понимания реакции на терапию и для разработки новых стратегий в борьбе с данным заболеванием.

Прогноз позволяет дать оценку общей выживаемости (ОВ) пациента. В ходе исследований было показано, что медианаОВ пациентов с ММ при своевременной терапии составляет 6 лет.  В подгруппе пациентов, подходящих для аТГСК, медиана общейвыживаемостисоставляет 8 лет. Среди пожилых пациентов (возраст> 75 лет) медиана ОВ ниже и составляет примерно 5 лет. Однако, важно понимать, что данные показатели могут не отражать истинную картину ОВ, поскольку они были получены в результате исследований, в которых обычно не учувствуют пациенты с большим количеством сопутствующих заболеваний и плохим социальным статусом [25]. Тем не менее, эти данные являются ориентирами и могут быть обобщены для больных с недавно диагностированной ММ.

Для получения более точного прогноза необходимо оценить опухолевую нагрузку (стадию) и биологию заболевания (наличие молекулярно-генетических аномалий высокого риска или повышенного уровня лактатдегидрогеназы). Данные факторы оцениваются в пересмотренной системе стадирования (RISS) для создания единого прогностического индекса. Для обеспечения единообразия в RISS используются только широкодоступные цитогенетические маркеры:трисомии, t (11;14), t (6;14), t (4;14), t (14;16), t (14;20), del 17p, + 1q. Также дополнительную информацию для получения прогноза и выбора терапевтической стратегии дает разработанная в клинике Мэйо модель стратификации риска, названную стратификацией Майо (mSMART), которая делит пациентов на 2 категории: высокий и стандартный риск [25].

Таблица №1: «Стратификация риска множественной миеломы Мэйо (mSMART)»

Таким образом, можно выделить 2 группы прогноза для пациентов с ММ:

• благоприятный, который будет определяться группой стандартного риска по mSMART и характеризоваться средней ОВ пациентов 7 – 10 лет, хорошим ответом на терапию и отсроченной аТГСК.

• неблагоприятный, который будет связан с группой высокого риска по mSMART, характеризоваться средней ОВ до 5 лет и нуждаются в ранней аТГСК.

Также важно отметить, что пациенты с ММ, относящиеся к группе высокого риска и уже имеющие при диагностике признаки более агрессивного заболевания, характеризуются более высокой вероятностью рецидива и более высокой степенью клональной эволюции [25].

Такие аномалии, как t (4; 14), t (14; 16),t(14,20), делеция части или всей хромосомы 13, а также делеция 17p13, являются маркером неблагоприятного прогноза; в то время как гипердиплоидия и транслокации t (11; 14), t(6;14) связаны с лучшим исходом. Значение делеции 13 хромосомы остается невыясненным, поскольку она также наблюдается у пациентов с MGUS с неясной связью с его трансформацией в ММ.

Среди специфических транслокаций 14q32, обсуждавшихся ранее, t (4; 14) является наиболее важной с клинической точки зрения. Ряд исследований подтвердили, что пациенты с данной аномалией имеют особенно плохой прогноз [15]. Это объясняется тем, что t (4; 14) приводит к одновременной сверхэкспрессии двух генов - FGFR3 и MMSET. Тем не менее главенствующую роль в формировании неблагоприятного прогноза отдают MMSET, сверхэкспрессия которого является универсальной особенностью, а FGFR3 в свою очередь может отсутствовать примерно в 30% случаев. Исследования показали, что клетки ММ зависят от экспрессии MMSET, подавление этого гена выражалось в ингибировании пролиферации клеток миеломы, остановке клеточного цикла и апоптозе. Также было обнаружено, что уровень мРНК MMSET повышается в 15 из 40 типов других опухолей. Таким образом, t (4; 14), приводящая к сверхэкспрессии MMSET, может способствовать развитию других типов злокачественных заболеваний. Del 13q у большинства пациентов сочетается c транслокацией t (4; 14), поэтому пока в настоящее время не ясно, имеет ли del13q прогностическое значение, независимое от транслокаций t (4; 14). Наиболее важным для прогноза хромосомным изменением является del (17p). Эта делеция, присутствующая у 8–10% пациентов, связана с чрезвычайно короткой выживаемостью, независимо от применяемой терапии. В результате данного генетического события наблюдается полная утрата одно копии гена TP53. Однако, делеция нередко сопровождается мутацией в этом же гене, что приводит к двуаллельной потере TP53. Такое сочетание является маркером неблагоприятного исхода, а также геномной нестабильности [8].

Таблица №2: «Генетические аномалии клинического значения»

Выводы

Таблица №3 Фармакологическое лечение миеломы в зависимости от выявляемых генетические аномалий

Таблица №4 «Лабораторные тесты для обследования пациента с множественой миеломой»