Скрининг парапротеинемий в моче с помощью иммунофиксации

Определение типа протеинурии с помощью электрофореза мочи

Протеинурией называют повышение содержания белка в моче, которое является клинико-лабораторным показателем нарушения функции мочевыделительной системы при различных заболеваниях. При измерении концентрации белка в моче диагноз проетинурии устанавливается при повышении его содержания более 1,0 г/л. В отличие от измерения концентрации белка с помощью биохимических тестов, электрофорез белков мочи позволяет не только выявить, но и охарактеризовать спектр выделяемых белков с помощью полуколичественного измерения белковых фракций. При обнаружении патологической белковой фракции (белка Бенс-Джонса) тест считается положительным независимо от концентрации общего белка.

При электрофорезе разделение белков осуществляется по массе и заряду. В норме, когда протеинурия отсутствует, фракции белка в моче не определяются. По мере развития поражения нефрона часть белковых фракций начинает проявляться с типом миграции, аналогичным миграции данных белков в сыворотке крови. Последовательность появления белковых фракций зависит от первичной локализации патологического процесса .

Рисунок 1. Белки, обычно выявляемые при протеинурии.

Тип протеинурии устанавливается на основе анализа распределения белковых фракций и позволяет оценить локализацию и степень повреждения нефрона, а также выявить наличие парапротеина. Различают следующие варианты протеинурии:

Функциональная протеинурия

Представляет собой транзиторное состояние, возникающее вследствие минимального вторичного повреждения нефрона, например, при интенсивной физической нагрузке, беременности, лихорадке, острой сердечной недостаточности, общем перегревании или переохлаждении, обильном потреблении белковой пищи (алиментарная протеинурия) или приёме нефротоксичных препаратов. Как правило, функциональная протеинурия представлена небольшим количеством белка (до 500 мг/л), однако, при наличии примесей или контаминации образца концентрация достигать 1,0 г/л [6]. Чаще всего функциональная протеинурия представлена небольшим количеством альбумина. В ряде случаев могут выявляться глобулярные белки, характерные для гломерулярной и тубулярной протеинурии. Важной особенностью функциональной протеинурии является самопроизвольное разрешение с течением времени.

Микроальбуминурия является стойким патологическим состоянием, которое считается потенциально-обратимым, и представлена практически исключительно альбумином с суточной потерей белка от 30 до 300 мг. Микроальбуминемия является проявлением начальной стадии первичных (гломерулонефрит, киста в почке), либо вторичных нефропатий, являющихся результатом поражения органов-мишеней при ряде заболеваний (сахарный диабет, гипертоническая болезнь, атеросклероз, системная красная волчанка и др.). Персистенция микроальбуминурии на фоне лечения основного заболевания является неблагоприятным признаком [5]. Для лабораторного подтверждения микроальбуминурии необходимо провести иммунохимическое измерение альбумина (микроальбумина) в образце суточной мочи.

Рисунок 2. Формирование основных типов протеинурии при заболеваниях почек

Гломерулярная протеинурия

Гломерулярная протеинурия является проявлением поражения клубочка, сопровождающегося нарушением проницаемости почечного барьера. Данный тип протеинурии характерен для гломерулонефритов, в частности, мембранозного гломерулонефрита, болезни минимальных изменений, IgA-нефропатии, волчаночного нефрита и диабетической нефропатии. Выраженная гломерулярная протеинурия может возникнуть при тяжёлом течении гестоза и эклампсии. Обнаружение гломерулярной протеинурии у больных с парапротеинемией указывает на развитие одной из форм поражения клубочка при моноклональных гаммапатиях: AL-амилоидоза, болезни отложения лёгких цепей иммуноглобулинов, иммунотактоидного гломерулонефрита и др.

В норме стенки капилляров почечного клубочка в процессе фильтрации пропускают только низкомолекулярные белки. При повреждении почечного барьера в фильтрат начинают проникать белки с массой более 50 kDa, часть из которых реабсорбируется в почечных канальцах. Обычно канальцы способы к абсорбции не более 10 г/л белка в сутки. Селективность гломерулярной протеинурии определяется молекулярной массой белков, выявляемых при электрофорезе, которая пропорциональна степени повреждения почечного барьера. Начальные стадии повреждения клубочка проявляются увеличенной экскрецией альбумина (микроальбуминурия). При высокоселективной протеинурии в моче, помимо альбумина, определяется трансферрин. При умеренно селективной протеинурии появляются фракции, указывающие на экскрецию альфа-1 антитрипсина, IgG, однако альбумин остаётся преобладающей фракцией протеинограммы мочи. При неселективной протеинурии стенки капилляра клубочка практически полностью утрачивают свои барьерные свойства, пропуская наиболее высокомолекулярные белки: альфа-2 макроглобулин и IgM. Таким образом, характерными чертами неселективной протеинурии являются визуализация всех белковых фракций с формированием паттерна миграции, аналогичного сыворотке крови (включая альфа-2 фракцию), снижение процента альбумина среди экскретируемых белков, а также проявления нефротического синдрома на протеинограмме сыворотки крови (гипоальбуминемия, увеличение альфа-2 фракции, снижение альфа-1 и бета фракций белков).

Тубулярная протеинурия

Тубулярная протеинурия характерна для тубулоинтерстициального нефрита, НПВС-нефропатии, хронического пиелонефрита  и везикоуретрального рефлюкса, острой почечной недостаточности, отравлений нефротоксичными препаратами и соединениями. Формы вторичного повреждения почечных канальцев при моноклональных гаммапатиях включают синдром Фанкони, проксимальную тубулопатию и цилиндровую нефропатию.

Нарушение функции почечных канальцев характеризуется появлением в моче низкомолекулярных белков, таких как орозомукоид, бета-2 микроглобулин, альфа-2 микроглобулин, легкие цепи иммуноглобулинов и лизоцим. Для тубулярной протеинурии характерен относительно небольшой процент содержания альбумина, который уступает по содержанию бета-2 микроглобулину.

Преренальная протеинурия

Преренальная протеинурия, или протеинурия переполнения, возникает при попадании в мочу больших количеств одинакового белка вследствие повышения его содержания в крови. Изначально механизм протеинурии переполнения не связан с повреждением нефрона.

Наиболее частой причиной преренальной протеинурии (протеинурия переполнения) является наличие белка Бенс-Джонса (М-градиента, представленного моноклональными лёгкими цепями иммуноглобулинов: каппа или лямбда). Обнаружение парапротеина в моче характерно для множественной миеломы (особенно для болезни лёгких цепей) и других заболеваний группы «плазмаклеточных дискразий», которые включают MGUS, AL амилоидоз, макроглобулинемию Вальденстрёма, B-клеточную неходжскинскую лимфому, B-клеточную лейкемию. Другими распространёнными причинами протеинурии переполнения являются свободные поликлональные цепи иммуноглобулинов и бета-2 микроглобулин, реже гемоглобин при остром гемолизе и миоглобин при рабдомиолизе.

Постренальная протеинурия

Постренальная протеинурия характеризуется попаданием в мочу всего спектра белков сыворотки крови при поражении мочевыводящего тракта, инфекции, гематурии или менструации. При попадании небольшого количества белков в мочу критерием постренальной протеинурии является соотношение фракций, аналогичное протеинограмме сыворотки крови. При выраженной гематурии характер миграции белков становится идентичным тяжёлой неселективной протеинурии, что требует комплексной интерпретации результатов исследования.

Определение парапротеина в моче (белка Бенс-Джонса) методом электрофореза с иммунофиксацией

Наличие парапротеина в моче является характерным проявлением некоторых форм моноклональных гаммапатий. В зависимости от варианта гаммапатии, парапротеин в моче может быть представлен:

• моноклональными свободными лёгкими цепями иммуноглобулинов (белком Бенс-Джонса);
• свободными цепями и целыми молекулами моноклональных иммуноглобулинов;
  
• только целыми моноклональными иммуноглобулинами (интактным парапротеином);
  

Моноклональные свободные лёгкие цепи обладают нефротоксическим действием, поэтому со временем в зависимости типа поражения нефрона со временем к протеинурии переполнения может присоединяться гломерулярная, тубулярная или сочетанная протеинурия. Для скрининга и подтверждения наличия парапротеина в моче выполняется электрофорез с иммунофиксацией, при котором визуализация М-компонента осуществляется с помощью специфического окрашивания с использованием антител к лёгким (анти-κ и анти-λ) и тяжёлым цепям иммуноглобулинов (анти-IgG, анти-IgA, анти-IgM, а также анти-IgE и анти-IgD антисыворотки) [2]. Характер почечной патологии при моноклональных гаммапатиях зависит от класса парапротеина и некоторых других индивидуальных особенностей больного (см. таблица 1).

Таблица 1. Варианты формирования моноклонального парапротеина в моче

Моноклональные иммуноглобулины со свободными лёгкими цепями и интактные моноклональные иммуноглобулины в моче присутствуют практически у трети больных с множественной миеломой IgG, IgA и IgD классов. Наиболее часто наличие моноклональных иммуноглобулинов в моче отражает степень повреждения клубочка. Ещё один механизм утечки моноклональных иммуноглобулинов связан с нарушением функции FcRn-рецептора, которое приводит к повышению катаболизма иммуноглобулинов. Экскреция целых молекул иммуноглобулинов ассоциирована с более низкой скоростью клубочковой фильтрации по сравнению с экскрецией только лёгких цепей у больных с множественной миеломой.

Лабораторная диагностика

Лабораторное выявление парапротеина в моче и определение типа протеинурии осуществляется с помощью сочетания классического электрофореза мочи и электрофореза с иммунофиксацией. Метод электрофореза позволяет установить тип протеинурии на основании паттерна миграции белков мочи. В норме фракции белка при электрофорезе мочи отсутствуют. Метод иммунофиксации представляет собой модификацию электрофореза, при которой окрашивание белков осуществляется селективно с использованием антисывороток к лёгким (κ, λ) и тяжёлым цепям иммуноглобулинов: γ (в составе IgG), δ (в составе IgD), α (в составе IgA), μ (в составе IgM) и ε (в составе IgM). При верификации парапротеина с помощью иммунофикации на денситограмме в аналогичной зоне производится выделение и расчёт абсолютного значения М-компонента.

При доброкачественных парапротеинемиях белок Бенс-Джонса в моче не обнаруживается, что позволяет использовать его выявление в качестве основного метода скрининга злокачественных форм парапротеинемий. Выявление белка Бенс-Джонса проводится с помощью исследования Скрининг белка Бенс-Джонса в разовой моче (тест 02-05-004). При обнаружении белка Бенс-Джонса проводится типирование его состава с помощью панели антисывороток (Иммунофиксация белка Бенс-Джонса с панелью антисывороток, тест 02-05-007).

Комбинированное исследование парапротеина в сыворотке и белка Бенс-Джонса в моче позволяет исключить диагноз парапротеинемии (и моноклональной гаммапатии) при неясной клинической картине  с помощью комплексного обследовния Скрининг парапротеинов в сыворотке и моче (тест 01.02.15.651). 

Рис. 3 Алгоритм диагностики белка Бенс-Джонса в моче

Интерпретация

• Парапротеина, представленного каппа/лямбда лёгкими цепями (белка Бенс-Джонса) или моноклональными иммуноглобулинами, в образце мочи не обнаружено. Отсутствие парапротеина в моче (белка Бенс-Джонса) при скрининговом исследовании образца мочи с помощью иммунофиксации значительно снижает вероятность вероятность парапротеинемии, сопровождающихся синтезом свободных лёгких цепей, но не исключает наличие парапротеина в сыворотке крови. Белок Бенс-Джонса представляет собой моноклональные свободные лёгкие цепи иммуноглобулинов, которые профильтровались в мочу и обладают нефротоксическим действием. Наличие белка Бенс-Джонса в моче наиболее характерно для болезни лёгких цепей, поэтому отрицательный результат теста с высокой вероятностью исключает это заболевание. В некоторых случаях парапротеин в моче представлен не свободными цепями, а целыми молекулами моноклональных иммуноглобулинов, которые по определению не являются белком Бенс-Джонса. Протеинурия Бенс-Джонса является вариантом преренальной протеинурии, при которой избыточное содержание белка в плазме крови превышает реабсорбционную способность почек. Отсутствие белка Бенс-Джонса не исключает протеинурию иного характера, которая в зависимости от уровня поражения нефрона быть гломерулярной, тубулярной, смешанной или постренальной.

• В образце мочи обнаружен парапротеин (белок Бенс-Джонса). Обнаружение парапротеина в моче (белка Бенс-Джонса) при скрининговом исследовании образца мочи с помощью иммунофиксации указывает на моноклональную гаммапатию. Наиболее вероятно наличие тех форм гаммапатий, которые сопровождаются секрецией свободных лёгких цепей иммуноглобулинов (болезнь лёгких цепей, другие формы миеломы, MGUS с парапротеином в моче и др). Свободные моноклональные лёгкие цепи иммуноглобулинов, попавшие в мочу, называют белком Бенс-Джонса. Протеинурия Бенс-Джонса является вариантом преренальной протеинурии, которая обусловлена избыточным содержанием белка в плазме крови. При этом лёгкие цепи обладают нефротоксическим действием, поэтому со временем в зависимости от уровня поражения нефрона может присоединяться гломерулярная или тубулярная протеинурия. В редких случаях парапротеин в моче может быть представлен не свободными лёгкими цепями, а интактным парапротеином (целые молекулы моноклональных иммуноглоублинов), т.е. не является белком Бенс-Джонса по определению. Дополнительно может быть рекомендовано определение свободных лёгких цепей иммуноглобулинов в моче и сыворотке, иммунофиксация образца мочи для определения типа парапротеина.