Развернутое молекулярно-генетическое исследование при опухолях щитовидной железы (мутации в генах KRAS, NRAS, HRAS, BRAF, TERT, RET/PTC1, RET/PTC3, PAX8/PPAR)

Рак щитовидной железы (РЩЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием эндокринных желез с ростом заболеваемости за последние 25 лет примерно в два раза.

Стандартной диагностической процедурой при образованиях ЩЖ является тонкоигольная аспирационная биопсия (ТАБ). Примерно 20–30% результатов полученных в результате ТАБ классифицируются как «неопределенные», относящиеся к диагностическим категориям III–V по классификации Bethesda Thyroid Classification 2017. Наиболее распространенной и сложной для интерпретации является цитологическая категория IV – фолликулярная неоплазия или подозрение на нее. Риск наличия злокачественного процесса при данной категории варьирует от 25 до 40%. Это обусловлено тем, что дифференциальная диагностика образований, имеющих фолликулярный паттерн, на цитологическом уровне, как правило, невозможна. При этом среди хирургически резецированных опухолей ЩЖ, цитологически оцениваемых как «неопределенные», злокачественными поражениями являются только 15–30% случаев. Таким образом, существует необходимость в методах более точной дооперационной диагностики.

Молекулярно-генетические исследования имеют при РЩЖ несколько основных направлений: 1) дифференциальная диагностика опухолей ЩЖ; 2) прогностическое значение выявленных мутаций; 3) определение показаний к таргетной терапии.

Определение точечных мутаций в гене BRAF, генах семейства RAS (KRAS, NRAS, HRAS), а также транслокаций RET/PTC1, RET/PTC3 и PAX8/PPARG у пациентов с узловыми образованиями категорий III–V по Bethesda является одним из методов оценки риска наличия злокачественной опухоли ЩЖ.

В зависимости от клеток, из которых образовалась опухоль, можно выделить несколько гистологических подтипов РЩЖ, каждый из которых имеет различные характеристики и прогноз.

Высокодифференцированный рак щитовидной железы (ВДРЩЖ) происходит из фолликулярных клеток и встречается примерно в ~95% всех случаев заболевания. ВДРЩЖ делится на четыре группы:

• папиллярный рак щитовидной железы (ПРЩЖ) - 85%,

• фолликулярный рак щитовидной железы (ФРЩЖ) - 10%

• низкодифференцированный рак щитовидной железы (НДРЩЖ) - 1–1,5%

• анапластический рак (АРЩЖ) <1%

Последние две формы представляют собой более агрессивные формы РЩЖ, в сравнении с ПРЩЖ и ФРЩЖ.

Кроме того, около ~5% случаев РЩЖ происходит из парафолликулярных клеток и является медуллярным раком щитовидной железы (МРЩЖ).

РЩЖ характеризуется молекулярными изменениями, такими как активирующие/инактивирующие мутации, перестройки, делеции и изменения числа копий в генах, ответственных за пролиферацию клеток, дифференцировку и апоптоз. Гены, аберрации в которых обнаруживаются при РЩЖ, кодируют тирозинкиназные трансмембранные белки RET, NTRK1, а также внутриклеточные вторичные посредники сигнала BRAF и RAS (KRAS, NRAS, HRAS).

Гены HRAS, KRAS, NRAS кодируют G-белки, располагающиеся на внутренней части клеточной мембраны и передающие сигнал от тирозинкиназных рецепторов по сигнальным путям MAPK и PI3K/AKT. При РЩЖ мутации в кодонах 61 генов NRAS и HRAS встречаются чаще всего. Мутации в RAS-генах обнаруживаются в 10-20% случаев ПРЩЖ, 40-50% случаев ФРЩЖ и 20-40% случаев НДРЩЖ и АРЩЖ. Среди ПРЩЖ, практически все RAS-ассоциированные опухоли формируют неопластические фолликулы без папиллярных структур и, таким образом, диагностируются как ФВПРЩЖ. Мутации в RAS-генах встречаются в 20-40% доброкачественных фолликулярных аденомах. Обнаружение мутаций в RAS-генах в доброкачественных аденомах говорит о том, что RAS-положительные фолликулярные аденомы могут служить прекурсорами для RAS-положительных фолликулярных карцином и ФВПРЩЖ. Более того, RAS-мутации предрасполагают к трансформации высокодифференцированного рака в анапластические образования. Мутации RAS в сочетании с мутацией TERT были ассоциированы с более агрессивным течением заболевания, высоким риском рецидива и смертностью.

При РЩЖ BRAF активируется точечными мутациями, малыми делециями или инсерциями и хромосомными перестройками. Наиболее частым механизмом активации является замена валина на глутамин в позиции 600 транслируемого белка (V600E). Данная аберрация встречается в 98-99% процентов всех мутаций, выявляемых в гене BRAF при РЩЖ. Мутация BRAF V600E представляет собой наиболее частую аберрацию, обнаруживаемую при папиллярном РЩЖ (40-50% случаев). Также данная мутация встречается в 20-40% случаев НДРЩЖ и 30-40% случаев АРЩЖ. Гистологически во многих случаях BRAF-ассоциированных карцином обнаруживаются области высокодифференцированного папиллярного рака, и BRAF-положительные клеточные линии присутствуют во всех областях опухоли, что говорит о том, что появление V600E является ранним событием и предрасполагает к дедифференцировке опухоли. При папиллярном РЩЖ BRAF V600E -мутация обнаруживается чаще всего в двух вариантах ПРЩЖ: классическом и высококлеточном. В то же время, BRAF V601 гистологически может быть представлена фолликулярным вариантом.

Мутации в гене BRAF отсутствуют в доброкачественных узлах ЩЖ, однако они выявляются в трети случаев АРЩЖ. Определение мутации BRAF V600E рекомендовано всем пациентам с высокодифференцированным раком щитовидной железы для послеоперационной стратификации риска рецидива в целях определения тактики ведения пациентов.

PPARG представляет собой ядерный рецептор, участвующий в регуляции клеточного цикла и апоптоза. PAX8 является транскрипционным фактором, регулирующим активность тиреоидо-специфических генов. Транслокация PAX8/PPARG представляет собой слиянии части гена PAX8 и гена PPARG, что приводит к гиперэкспрессии химерного PAX8/PPARG белка. Аберрация PAX8/PPARG возникает в 30-35% случаев при фолликулярном РЩЖ. Данная перестройка редко встречается при фолликулярных аденомах (2-13%) и ФВПРЩЖ (1-5%). Транслокация PAX8/PPARG ассоциируется с развитием фолликулярной карциномы в раннем возрасте и высоким уровнем сосудистой инвазии. С точки зрения клинической значимости, обнаружение мутации PAX8/PPARG говорит о фолликулярной структуре опухоли с предрасположенностью к ранней сосудистой инвазии, но в то же время данная аберрация может встречаться и в доброкачественных образованиях. Несмотря на это, обнаружение перестройки PAX8/PPARG при фолликулярной неоплазии предсказывает конверсию доброкачественного образования в рак.

Транслокация RET/PTC встречается в основном при папиллярном РЩЖ в 10-20% случаев. При транслокации ген RET сливается с одним из генов-партнеров. Данная химерная конструкция ведет к постоянной стимуляции MAPK сигнального пути и злокачественного перерождения клеток. Наиболее частыми перестройками являются RET/PTC1 (70% случаев) и RET/PTC3 (до 30% случаев). Обе перестройки представляют собой парацентрические, интрахромосомные инверсии, так как все гены, образующие структуру, находятся на одной и той же 10 хромосоме. Распространенность и специфичность RET/PTC перестройки при папиллярном РЩЖ варьирует в различных исследованиях. Примерно у 20% детей с ПРЩЖ выявляют перестройку RET/PTC1 или RET/PTC3. Перестройки RET/PTC были выявлены при доброкачественных заболеваниях ЩЖ, так, высокая распространенность RET/PTC обнаружена у пациентов с тиреоидитом Хашимото.

Ген TERT кодирует каталитическую субъединицу теломеразной обратной транскриптазы, которая выполняет ключевую роль в поддержании длины теломер. Наиболее распространенной мутацией TERT является C228T, реже C250T. Точечные мутации гена TERT не обнаружены при доброкачественных опухолях ЩЖ и при МРЩЖ, частота встречаемости при ВДРЩЖ невысока и составляет 10%, однако достаточно велика при НДРЩЖ (40%) и АРЩЖ (до 73%). Обнаружение данной мутации при ТАБ может значительно улучшить дооперационную диагностику более агрессивных форм РЩЖ. Мутации гена TERT ассоциированы с агрессивными характеристиками опухоли ЩЖ: экстратиреоидным распространением, большим размером опухоли, метастазами в лимфатические узлы и отдаленными метастазами, более продвинутой стадией TNM, а также рецидивом опухоли и смертностью; с более агрессивным течением РЩЖ; агрессивными типами РЩЖ: НДРЩЖ, АРЩЖ. Мутации гена TERT не встречается при доброкачественных опухолях ЩЖ.

В сочетании мутации BRAF V600E и TERT имеют сильное синергетическое влияние на такие параметры, как агрессивность ПРЩЖ, увеличение риска рецидива и смертности пациентов, тогда как при отдельном выявлении мутаций оно существенно меньше.

Для дифференциальной диагностики опухолей ЩЖ проводится исследование основных, наиболее часто встречающихся молекулярных маркеров.

Среди онкогенных мутаций для ПРЩЖ наиболее характерны мутации в генах: BRAF V600E, RAS, генные перестройки RET/PTC.

Для ФРЩЖ наиболее характерны мутации, отображающие перестройки PAX8/PPARγ, мутации в генах RAS.

Согласно рекомендациям 2015 г. Американской Тиреоидологической Ассоциации и 2016 г. Американской ассоциации клинических эндокринологов, можно применять молекулярно-генетического тестирования при неопределенных результатах ТАБ (диагностические категории III, IV по классификации Bethesda). Рекомендуется исследование на BRAF, RET/PTC, PAX8/PPARG и можно рассмотреть мутации RAS.

Мутация V600E в гене BRAF и мутации в промотерном регионе гена TERT обладают специфичностью в отношении карциномы ЩЖ. Мутация V600E в гене BRAF взаимосвязана с агрессивным клинико-морфологическим течением заболевания. Обнаружение мутаций в комплексной молекулярно-генетической панели при наиболее сложной в интерпретации категории IV по классификации Bethesda обусловливает высокую вероятность наличия злокачественного процесса.