Антитела к циклическому цитруллин-содержащему пептиду (anti-CCP2), тест 2-го поколения

Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП) – cyclic citrullinated peptide – CCP или anti-citrullinated peptide antibody (ACPA), направлены против коротких последовательностей измененных белков воспаленной синовиальной оболочки при ревматоидном артрите (РА). Открытие АЦЦП  стало одним из наиболее важных достижений иммунологической диагностики последних десятилетий. В ходе этих исследований удалось расшифровать целое семейство аутоантигенов при ревматоидном артрите (РА), содержащих аминокислоту цитруллин. АЦЦП входят в семейство "антицитруллиновых антител", наряду с другими аутоантителами: антикератиновыми антителами и антителами к модифицированному виментину (MCV). Это позволило включить антитела к циклическому цитруллиновому пептиду (А ЦЦП или анти ССР), наряду с ревматоидным фактором, в пересмотренные критерии ревматоидного артрита 2010 года. Кроме высокой специфичности в дебюте артрита (недифференцированного артрита), антитела к цитруллиновому пептиду (АЦЦП) определяют пациентов с высокой вероятностью деструктивного артрита. Таким образом, уже на этапе ранней диагностики антитела к цитруллиновому пептиду позволяют установить прогноз заболевания и назначить высокоэффективную иммуносупрессивную терапию.

История описания и мишени антицитруллиновых антител при ревматоидном артрите

Исходным пунктом для этого открытия была идентификация целевого антигена для антикератиновых антител (АКА). Это было впервые описано Young в 1979 году, и АКА оказались высокоспецифичны для РА (Van Venrooij W.J. etal., 2000). Антигеном-мишенью является филаггрин, белок, который специфично экспрессируется в кератин-продуцирующих эпителиальных клетках и имеет характерную третичную структуру. Поскольку филаггрин экспрессируется только эпителиальными клетками ороговевающего эпителия и его нет в суставах или других внутренних органах, то патогенетическое значение этого процесса было первоначально неясным. Schellekens G.A. et al. (1998) показали, что только цитруллинированные формы филаггрина распознаются антикератиновыми антителами. В дальнейшем было продемонстрировано, что эти антитела распознают цитруллиновые эпитопы белка филаггрина, в том числе антигены АЦЦП. Цитруллинизация  представляет собой посттрансляционную модификацию таких белков как филаггрин, в котором аминокислота аргинин конвертируется в цитруллин посредством дезаминирования. Этот процесс физиологически играет роль в клеточной дифференциации, например, кератинизации, апоптозе, а также при воспалительных процессах. Процесс цитруллинирования неспецифичен для РА, а также для белков синовиальной оболочки, поскольку цитруллинирование наблюдается во многих тканях в процессе старения вследствие воспаления и интоксикаций, а также апоптоза и перестройки клеток ткани (Goronzy J.J. etal., 2009). Количественное различие в степени цитруллинирования может играть большую роль в инициации иммунного ответа, который приводит к формированию АЦЦП. Это повышает важность изучения цитруллинирования и других посттрансляционных модификаций антигенов аутоантител при различных аутоиммунных заболеваниях. Любопытно отметить, что курение, которое считается внешним фактором риска развития РА, коррелирует с повышенным цитруллинированием антигенов в соединительной ткани легких, и формированием АЦЦП и других антицитруллиновых аутоантител (Klareskog L. etal., 2006). Повышенное содержание клеток с цитруллиновыми белками в бронхоальвеолярном лаваже, полученном от курящих, может иметь патогенетическое значение для этого системного заболевания. Курение вызывает такой ответ преимущественно у лиц, имеющих общий эпитоп в составе HLA-DRB1 (Linn-Rasker S.P. etal., 2009).

Исследования мишеней антицитруллиновых антител показали, что распознаваемые при РА аутоантитела являются преимущественно цитруллинированными фрагментами многих белков синовиального матрикса белков, включая филаггрин, кератин, фибриноген и виментин (vanBoekelM.A. etal., 2002; VossenaarE.R. etal., 2004). Фибрин и фибриноген также могут рассматриваться как цитруллинированные антигены. Исследования обнаружили тесную перекрестную реактивность между филаггрином и цитруллинированным фибрином (Sebbag M. et al., 2006). Несколько публикаций подтвердили высокую диагностическую специфичность и чувствительность для определения антител к цитруллинированному фибриногену у больных РА (Van der Cruyssen B. et al., 2006). С помощью ИФА метода выявление таких антител имело диагностическую чувствительность в диагностике РА около 75% при специфичности 98%. Таким образом, диагностические свойства этого антигена при РА были сравнимы с выявлением АЦЦП. Более того, антитела к цитруллинированному фибриногену и АЦЦП также сравнимы по чувствительности и специфичности при раннем РА (Neilen M.M. et al., 2005). Однако пока нет стандартизованных тестов для практического выявления антител к цитруллинированному фибриногену, которые могли бы использоваться в рутинной лабораторной диагностике (Egerer К. et al., 2009). Другим интересным цитруллинированным аутоантигеном, описанном при РА, является цитруллинированная форма альфа-энолазы, энзима, который играет роль в процессе гликолиза (Kinloch A. et al., 2005). Цитруллинированная альфа-энолаза была найдена в синовиальной ткани у пациентов с РА. Однако пока нет окончательных данных по диагностической чувствительности и специфичности этого маркера. В ряде исследований заявляется специфичность, составляющая более 97% у пациентов с ранним РА, что даже превосходит параметры АЦЦП (Saulot V. et al., 2002).

Патогенетическая и диагностическая роль АЦЦП

Цитруллинированные протеины, скорее всего, образуются в синовиальной оболочке (Vossenaar E.R. et al., 2003) и антитела, включая АЦЦП, образуются в воспаленной синовии местными плазматическими клетками (Masson-Bessiere C. et al., 2000). Более того, В-клетки и плазмоциты, продуцирующие АЦЦП, были обнаружены в синовиальной жидкости у АЦЦП-позитивных больных с РА (Reparon-Schuijt C.C. et al., 2001).

В обзоре, выполненном Nishimura et al. (2007), приведены результаты метаанализа литературных публикаций, который выявил большую специфичность АЦЦП для диагностики РА по сравнению с ревматоидным фактором, что совпадает с выводами других систематических обзоров (Riedemann J.P. et al., 2006). По данным метаанализа, проведенного Nishimura et al. (2007) по литературным данным за последние 10 лет, чувствительность, специфичность, положительная и отрицательная вероятность диагноза РА при определении АЦЦП составили 67% (95% CI, 62% до 72%), 95% (CI, 94% до 97%), 12.46 (CI, 9.72 до 15.98) и 0.36 (CI, 0.31 до 0.42), соответственно. Для РФ класса IgM те же значения составили 69% (CI, 65% до 73%), 85% (CI, 82% до 88%), 4.86 (CI, 3.95 до 5.97) и 0.38 (CI, 0.33 до 0.44). Отношения вероятности среди IgM-РФ, IgG-РФ и IgA-РФ оказались одинаковыми. В трех из четырех исследований было показано, что риск рентгенологической прогрессии для положительной АЦЦП была выше, чем для положительного IgM РФ. Поэтому АЦЦП представляются более специфичным, чем РФ в диагностике РА, и могут лучше предсказать будущие эрозивные изменения (Nishimura K. et al., 2007). У здоровых людей с наличием АЦЦП РА развивается значительно более часто, чем у лиц, у которых АЦЦП не был обнаружен (Rantapaa-Dahlqvist S. et al. 2004).

Для изучения частоты и предсказательного значения выявления АЦЦП в общей популяции  для прогнозирования развития РА были получены образцы сывороток 1213 жителей (422 мужчин, 791 женщин) в одном из городов в префектуре Hyogo (Япония), которые проходили ежегодное физикальное обследование в 2000 году. В образцах были ретроспективно определены АЦЦП и РФ. Также были собраны истории болезни, клинические данные и результаты лабораторных тестов (например, высоко чувствительный CРБ (hsСРБ)) из базы данных. Всего 7 больных с РА были включены в число испытуемых (частота РА - 0.6%). Оценивалось диагностическое значение АЦЦП и РФ для РА, чувствительность, специфичность и положительное предсказательное значение (positive predictive value (PPV)) в комбинации с или без значений hsСРБ в сыворотке крови. Среди 1213 образцов положительный результат АЦЦП оказался у 2.4% (29 из 1213) и РФ - у 6.6% (80 из 1213). Из 7 всего 5 образцов от РА больных были положительны как для АЦЦП, так и РФ. Один из двух других был положителен только для АЦЦП, и у одного пациента - оба теста были негативны. Чувствительность и специфичность для АЦЦП была 85.7% и 98.1%, и для РФ - 71.4% и 93.8% ретроспективно. PPV АЦЦП составила 20.7%  и РФ - 6.3%. Когда были подвергнуты скринингу результаты с уровнем СРБ 1 мг/л и более, то были выявлены 246 субъектов. Среди них АЦЦП-положительными оказалось 11 субъектов, включая 6 больных с РА (PPV - 54.5%). Но с другой стороны, PPV для РФ для РА было 26.3% (всего 5 РА больных среди 19 положительных по РФ). Таким образом, частота АЦЦП в общей популяции - 2.4%. Их PPV для РА составляет в Японии 20.7%, но PPV значительно увеличилась до 54.5% при комбинации с hsСРБ (p<0.05) (Hayashi N et al., 2007).

Биологические свойства АЦЦП важны для понимания этиопатогенеза РА. Как указывалось ранее, обнаружена связь между курением и определенными генами HLA-DR4 (HLA-DR*0401,*0101 и др.), доказанная только у пациентов РА с положительными результатами на АЦЦП (Klareskog L. et al.,  2006). Кроме того, при трансфузии АЦЦП тяжелее протекает артрит в вызываемой коллагеном модели РА у мышей (Kuhn K.A. et al., 2006). Исследования на близнецах показали, что генетический вклад в патогенез РА составляет около 60%. Специфические аллели HLA-DRBI локуса («общий эпитоп») ассоциированы с более агрессивным клиническим течением РА. Напротив, другие HLA-DRBI аллели играют скорее протективную роль. Протективные аллели (DRB1*03) обнаруживаются у лиц с АЦЦП-негативным РА (Wilk A.S., 2007; van der Helm-van Mil A.H. et al., 2008). Описанная ассоциация между HLA-DRBI локусом, содержащим «общим эпитопом», и риском РА отмечается только у АЦЦП-позитивных больных, но не у АЦЦП-негативных больных. Можно высказать предположение, что хотя чувствительность АЦЦП в диагностике РА определенно ниже 100%, но возможно положительный характер выявления данного биомаркера относится только к больным с прогнозом агрессивного течения раннего РА, поскольку является маркером наследственного варианта РА с наиболее тяжелым прогнозом. Полиморфизм PTPN22 гена, который кодирует белок, взаимодействующий с тирозинкиназой лимфоцитов, а также с генетическими вариантами связанного с рецептором ФНО фактора 1 (TRAF -1) и фактором комплемента 5 (С5), также ассоциируются с АЦЦП-позитивной формой РА (Yamamoto K. et al., 2007). Данные АЦА-статуса и генетического анализа могут оказаться полезными для создания в будущем системы стратификации риска РА (предсказательные маркеры). Известно, что фенотип ревматоидного артрита варьирует от легкого воспаления суставов, которое не сопровождается инвалидизацией, до тяжелой быстропрогрессирующей болезни с экстрасуставными проявлениями в виде синдрома Фелти, сухого кератоконъюктивита, интерстициальной болезни легких и ревматоидного васкулита. Представляется, что АЦЦП важны для определения фенотипа РА, поскольку характеризуют больных с экстенсивными структурными поражениями (Nishimura K. et al., 2005), значительными функциональными нарушениями (Quinn M.A. et al., 2006) и которые получают преимущества от назначения очень ранней антиревматической терапии (Van Dongen H. et al., 2006).

Методы выявления АЦЦП

Причиной появления всех антицитруллиновых антител является воспалительная модификация ряда белков (фибрина, альфа-енолазы, виментина, и т.д.) в синовиальной оболочке суставов при ревматоидном артрите с образованием в структуре белков остатков аминокислоты цитруллина. Исследования голландского профессора Walther van Venrooij позволили исследовать спектр эпитопов антицитруллиновых антител и разработать уникальный тест с использование циклического цитруллинового пептида, который напоминает антиген всех антицитруллиновых антител. Линейные цитруллиновые пептиды и циклические пептиды на основе белка филаггрина использовались в тест-системах первого поколении. Тест-системы первого поколения несколько менее чувствительны по сравнению со вторым поколением тест систем АЦЦП2/ССР2, которые основаны на улучшенной структуру антигена – «дизайнерский антиген». Иммуноферментные тест-системы АЦЦП второго поколения стали золотым стандартом выявления антител к циклическому цитруллиновому пептиду в клинических лабораториях.

Метод второй генерации для выявления АЦЦП антител позволяет обнаружить антитела у 70-75% пациентов РА. По чувствительности при РА выявление АЦЦП сопоставимо с чувствительностью обнаружения ревматоидного фактора. В тоже время, выявление ревматоидного фактора (РФ) недостаточно специфично для РА. РФ выявляется при многих аутоиммунных и инфекционных заболеваниях, низкие титры РФ в пожилом возрасте  могут отмечаться у 10-15%  лиц не больных РА. В отличие от РФ, специфичность обнаружения АЦЦП превосходит 95%. Антитела АЦЦП не встречаются у здоровых лиц, а вероятность обнаружения АЦЦП при других воспалительных поражениях суставов не превышает 2-3% случаев. Среднее содержание АЦЦП у здоровых доноров крови в 10 раз меньше, чем рекомендуемая производителем граница нормы.

Большим преимуществом антител АЦЦП/CCP является их появление задолго до начала клинических проявлений заболевания. Популяционные исследования, посвященные времени появления аутоантител АЦЦП в ходе РА, показали, что АЦЦП могут быть обнаружены задолго до развития клинических симптомов заболевания. До появления клинических симптомов заболевания в 34% случаев были обнаружены антитела к циклическому цитруллиновому пептиду. У 19% здоровых на момент обследования людей, был обнаружен ревматоидный фактор класса IgM (РФ IgM), причем в нескольких случаях появление антител предсказывало РА за 20 лет до появления симптомов заболевания. Частота обнаружения антител значительно нарастала к моменту, соответствующему 1,5 годам до постановки диагноза РА. После выявления минимального диагностического титра содержание антител обычно увеличивалось вплоть до срока постановки диагноза.

Таким образом, раннее выявление АЦЦП в дебюте заболевания, учитывая высокую клинико-диагностическую специфичностью этого показателя, делает АЦЦП крайне важным методом диагностики РА в дебюте суставного синдрома. Антитела к цитруллиновым антигенам могут отмечаться у многих пациентов, у которых с момента появления симптомов симметричного артрита мелких суставов кисти и утренней скованности не прошло 2-3 недель и ревматоидный фактор еще отсутствует.

Антитела к АЦЦП не только обнаруживаются на ранних стадиях РА, но и отмечаются у больных РА с быстрым рентгенологическим прогрессированием. Результаты анализа литературных данных показывают, что антитела к циклическому пептиду позволяют предсказать развитие деструкции приблизительно у 80% пациентов с РА и, в сочетании с РФ, представляют важный инструмент для раннего распознавания больных РА с неблагоприятным прогнозом заболевания уже на этапе установления диагноза. У пациентов с тяжелым течением РА, у которых выявлены высокие титры АЦЦП, может быть лучше эффект назначения анти-В-клеточной терапии. Хорошие клинико-диагностические характеристики выявления АЦЦП/APCA позволили включить их международные критерии ревматоидного артрита ACR/EULAR 2010 года (см. раздел диагностика ревматоидного артрита).

Референсные значения:   

• <30 RU/ml - антител не обнаружено; 
• 30-90 RU/ml  - низкие концентрации антител; 
• >90 RU/ml - высокая концентрация антител.

Интерпретация:

Выявление антител к циклическому цитруллиновому пептиду (АЦЦП/CCP/ACPA) значительно повышает вероятность диагноза ревматоидный артрит. На этапе раннего симметричного артрита обнаружение АЦЦП совместно выявлением ревматоидного фактора обладает максимальной чувствительностью составляющей 80-85%. Анализ содержания антител и его сопоставление с характером артрита и воспалительной реакцией рекомендуется проводить в соответствии с критериями диагностики ревматоидного артрита ACR/EULAR 2010 г.

Отрицательный результат исследования снижает вероятность заболевания и практически исключает вероятность тяжелого РА. Анализ результатов определения аутоантител целесообразно проводить совместно с оценкой содержания ревматоидного фактора, определения антинуклеарного фактора на НЕр2 клетках и типирования HLA-B27. Большинство пациентов с антителами к цитруллинированному виментину также положительны в отношении антител к модифицированному цитруллиновому виментину (MCV).