Антитела к циклическому цитруллин-содержащему пептиду (anti-CCP2), тест 2-го поколения

Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП) – cyclic citrullinated peptide – CCP или anti-citrullinated peptide antibody (ACPA), направлены против коротких последовательностей измененных белков воспаленной синовиальной оболочки при ревматоидном артрите (РА). Открытие АЦЦП  стало одним из наиболее важных достижений иммунологической диагностики последних десятилетий. В ходе этих исследований удалось расшифровать целое семейство аутоантигенов при ревматоидном артрите (РА), содержащих аминокислоту цитруллин. АЦЦП входят в семейство "антицитруллиновых антител", наряду с другими аутоантителами: антикератиновыми антителами и антителами к модифицированному виментину (MCV). Это позволило включить антитела к циклическому цитруллиновому пептиду (А ЦЦП или анти ССР), наряду с ревматоидным фактором, в пересмотренные критерии ревматоидного артрита 2010 года. Кроме высокой специфичности в дебюте артрита (недифференцированного артрита), антитела к цитруллиновому пептиду (АЦЦП) определяют пациентов с высокой вероятностью деструктивного артрита. Таким образом, уже на этапе ранней диагностики антитела к цитруллиновому пептиду позволяют установить прогноз заболевания и назначить высокоэффективную иммуносупрессивную терапию.

История описания и мишени антицитруллиновых антител при ревматоидном артрите

Исходным пунктом для этого открытия была идентификация целевого антигена для антикератиновых антител (АКА). Это было впервые описано Young в 1979 году, и АКА оказались высокоспецифичны для РА (Van Venrooij W.J. etal., 2000). Антигеном-мишенью является филаггрин, белок, который специфично экспрессируется в кератин-продуцирующих эпителиальных клетках и имеет характерную третичную структуру. Поскольку филаггрин экспрессируется только эпителиальными клетками ороговевающего эпителия и его нет в суставах или других внутренних органах, то патогенетическое значение этого процесса было первоначально неясным. Schellekens G.A. et al. (1998) показали, что только цитруллинированные формы филаггрина распознаются антикератиновыми антителами. В дальнейшем было продемонстрировано, что эти антитела распознают цитруллиновые эпитопы белка филаггрина, в том числе антигены АЦЦП. Цитруллинизация  представляет собой посттрансляционную модификацию таких белков как филаггрин, в котором аминокислота аргинин конвертируется в цитруллин посредством дезаминирования. Этот процесс физиологически играет роль в клеточной дифференциации, например, кератинизации, апоптозе, а также при воспалительных процессах. Процесс цитруллинирования неспецифичен для РА, а также для белков синовиальной оболочки, поскольку цитруллинирование наблюдается во многих тканях в процессе старения вследствие воспаления и интоксикаций, а также апоптоза и перестройки клеток ткани (Goronzy J.J. etal., 2009). Количественное различие в степени цитруллинирования может играть большую роль в инициации иммунного ответа, который приводит к формированию АЦЦП. Это повышает важность изучения цитруллинирования и других посттрансляционных модификаций антигенов аутоантител при различных аутоиммунных заболеваниях. Любопытно отметить, что курение, которое считается внешним фактором риска развития РА, коррелирует с повышенным цитруллинированием антигенов в соединительной ткани легких, и формированием АЦЦП и других антицитруллиновых аутоантител (Klareskog L. etal., 2006). Повышенное содержание клеток с цитруллиновыми белками в бронхоальвеолярном лаваже, полученном от курящих, может иметь патогенетическое значение для этого системного заболевания. Курение вызывает такой ответ преимущественно у лиц, имеющих общий эпитоп в составе HLA-DRB1 (Linn-Rasker S.P. etal., 2009).

Исследования мишеней антицитруллиновых антител показали, что распознаваемые при РА аутоантитела являются преимущественно цитруллинированными фрагментами многих белков синовиального матрикса белков, включая филаггрин, кератин, фибриноген и виментин (vanBoekelM.A. etal., 2002; VossenaarE.R. etal., 2004). Фибрин и фибриноген также могут рассматриваться как цитруллинированные антигены. Исследования обнаружили тесную перекрестную реактивность между филаггрином и цитруллинированным фибрином (Sebbag M. et al., 2006). Несколько публикаций подтвердили высокую диагностическую специфичность и чувствительность для определения антител к цитруллинированному фибриногену у больных РА (Van der Cruyssen B. et al., 2006). С помощью ИФА метода выявление таких антител имело диагностическую чувствительность в диагностике РА около 75% при специфичности 98%. Таким образом, диагностические свойства этого антигена при РА были сравнимы с выявлением АЦЦП. Более того, антитела к цитруллинированному фибриногену и АЦЦП также сравнимы по чувствительности и специфичности при раннем РА (Neilen M.M. et al., 2005). Однако пока нет стандартизованных тестов для практического выявления антител к цитруллинированному фибриногену, которые могли бы использоваться в рутинной лабораторной диагностике (Egerer К. et al., 2009). Другим интересным цитруллинированным аутоантигеном, описанном при РА, является цитруллинированная форма альфа-энолазы, энзима, который играет роль в процессе гликолиза (Kinloch A. et al., 2005). Цитруллинированная альфа-энолаза была найдена в синовиальной ткани у пациентов с РА. Однако пока нет окончательных данных по диагностической чувствительности и специфичности этого маркера. В ряде исследований заявляется специфичность, составляющая более 97% у пациентов с ранним РА, что даже превосходит параметры АЦЦП (Saulot V. et al., 2002).

Патогенетическая и диагностическая роль АЦЦП

Цитруллинированные протеины, скорее всего, образуются в синовиальной оболочке (Vossenaar E.R. et al., 2003) и антитела, включая АЦЦП, образуются в воспаленной синовии местными плазматическими клетками (Masson-Bessiere C. et al., 2000). Более того, В-клетки и плазмоциты, продуцирующие АЦЦП, были обнаружены в синовиальной жидкости у АЦЦП-позитивных больных с РА (Reparon-Schuijt C.C. et al., 2001).

В обзоре, выполненном Nishimura et al. (2007), приведены результаты метаанализа литературных публикаций, который выявил большую специфичность АЦЦП для диагностики РА по сравнению с ревматоидным фактором, что совпадает с выводами других систематических обзоров (Riedemann J.P. et al., 2006). По данным метаанализа, проведенного Nishimura et al. (2007) по литературным данным за последние 10 лет, чувствительность, специфичность, положительная и отрицательная вероятность диагноза РА при определении АЦЦП составили 67% (95% CI, 62% до 72%), 95% (CI, 94% до 97%), 12.46 (CI, 9.72 до 15.98) и 0.36 (CI, 0.31 до 0.42), соответственно. Для РФ класса IgM те же значения составили 69% (CI, 65% до 73%), 85% (CI, 82% до 88%), 4.86 (CI, 3.95 до 5.97) и 0.38 (CI, 0.33 до 0.44). Отношения вероятности среди IgM-РФ, IgG-РФ и IgA-РФ оказались одинаковыми. В трех из четырех исследований было показано, что риск рентгенологической прогрессии для положительной АЦЦП была выше, чем для положительного IgM РФ. Поэтому АЦЦП представляются более специфичным, чем РФ в диагностике РА, и могут лучше предсказать будущие эрозивные изменения (Nishimura K. et al., 2007). У здоровых людей с наличием АЦЦП РА развивается значительно более часто, чем у лиц, у которых АЦЦП не был обнаружен (Rantapaa-Dahlqvist S. et al. 2004).

Для изучения частоты и предсказательного значения выявления АЦЦП в общей популяции  для прогнозирования развития РА были получены образцы сывороток 1213 жителей (422 мужчин, 791 женщин) в одном из городов в префектуре Hyogo (Япония), которые проходили ежегодное физикальное обследование в 2000 году. В образцах были ретроспективно определены АЦЦП и РФ. Также были собраны истории болезни, клинические данные и результаты лабораторных тестов (например, высоко чувствительный CРБ (hsСРБ)) из базы данных. Всего 7 больных с РА были включены в число испытуемых (частота РА - 0.6%). Оценивалось диагностическое значение АЦЦП и РФ для РА, чувствительность, специфичность и положительное предсказательное значение (positive predictive value (PPV)) в комбинации с или без значений hsСРБ в сыворотке крови. Среди 1213 образцов положительный результат АЦЦП оказался у 2.4% (29 из 1213) и РФ - у 6.6% (80 из 1213). Из 7 всего 5 образцов от РА больных были положительны как для АЦЦП, так и РФ. Один из двух других был положителен только для АЦЦП, и у одного пациента - оба теста были негативны. Чувствительность и специфичность для АЦЦП была 85.7% и 98.1%, и для РФ - 71.4% и 93.8% ретроспективно. PPV АЦЦП составила 20.7%  и РФ - 6.3%. Когда были подвергнуты скринингу результаты с уровнем СРБ 1 мг/л и более, то были выявлены 246 субъектов. Среди них АЦЦП-положительными оказалось 11 субъектов, включая 6 больных с РА (PPV - 54.5%). Но с другой стороны, PPV для РФ для РА было 26.3% (всего 5 РА больных среди 19 положительных по РФ). Таким образом, частота АЦЦП в общей популяции - 2.4%. Их PPV для РА составляет в Японии 20.7%, но PPV значительно увеличилась до 54.5% при комбинации с hsСРБ (p<0.05) (Hayashi N et al., 2007).

Биологические свойства АЦЦП важны для понимания этиопатогенеза РА. Как указывалось ранее, обнаружена связь между курением и определенными генами HLA-DR4 (HLA-DR*0401,*0101 и др.), доказанная только у пациентов РА с положительными результатами на АЦЦП (Klareskog L. et al.,  2006). Кроме того, при трансфузии АЦЦП тяжелее протекает артрит в вызываемой коллагеном модели РА у мышей (Kuhn K.A. et al., 2006). Исследования на близнецах показали, что генетический вклад в патогенез РА составляет около 60%. Специфические аллели HLA-DRBI локуса («общий эпитоп») ассоциированы с более агрессивным клиническим течением РА. Напротив, другие HLA-DRBI аллели играют скорее протективную роль. Протективные аллели (DRB1*03) обнаруживаются у лиц с АЦЦП-негативным РА (Wilk A.S., 2007; van der Helm-van Mil A.H. et al., 2008). Описанная ассоциация между HLA-DRBI локусом, содержащим «общим эпитопом», и риском РА отмечается только у АЦЦП-позитивных больных, но не у АЦЦП-негативных больных. Можно высказать предположение, что хотя чувствительность АЦЦП в диагностике РА определенно ниже 100%, но возможно положительный характер выявления данного биомаркера относится только к больным с прогнозом агрессивного течения раннего РА, поскольку является маркером наследственного варианта РА с наиболее тяжелым прогнозом. Полиморфизм PTPN22 гена, который кодирует белок, взаимодействующий с тирозинкиназой лимфоцитов, а также с генетическими вариантами связанного с рецептором ФНО фактора 1 (TRAF -1) и фактором комплемента 5 (С5), также ассоциируются с АЦЦП-позитивной формой РА (Yamamoto K. et al., 2007). Данные АЦА-статуса и генетического анализа могут оказаться полезными для создания в будущем системы стратификации риска РА (предсказательные маркеры). Известно, что фенотип ревматоидного артрита варьирует от легкого воспаления суставов, которое не сопровождается инвалидизацией, до тяжелой быстропрогрессирующей болезни с экстрасуставными проявлениями в виде синдрома Фелти, сухого кератоконъюктивита, интерстициальной болезни легких и ревматоидного васкулита. Представляется, что АЦЦП важны для определения фенотипа РА, поскольку характеризуют больных с экстенсивными структурными поражениями (Nishimura K. et al., 2005), значительными функциональными нарушениями (Quinn M.A. et al., 2006) и которые получают преимущества от назначения очень ранней антиревматической терапии (Van Dongen H. et al., 2006).

Методы выявления АЦЦП

Причиной появления всех антицитруллиновых антител является воспалительная модификация ряда белков (фибрина, альфа-енолазы, виментина, и т.д.) в синовиальной оболочке суставов при ревматоидном артрите с образованием в структуре белков остатков аминокислоты цитруллина. Исследования голландского профессора Walther van Venrooij позволили исследовать спектр эпитопов антицитруллиновых антител и разработать уникальный тест с использование циклического цитруллинового пептида, который напоминает антиген всех антицитруллиновых антител. Линейные цитруллиновые пептиды и циклические пептиды на основе белка филаггрина использовались в тест-системах первого поколении. Тест-системы первого поколения несколько менее чувствительны по сравнению со вторым поколением тест систем АЦЦП2/ССР2, которые основаны на улучшенной структуру антигена – «дизайнерский антиген». Иммуноферментные тест-системы АЦЦП второго поколения стали золотым стандартом выявления антител к циклическому цитруллиновому пептиду в клинических лабораториях.

Метод второй генерации для выявления АЦЦП антител позволяет обнаружить антитела у 70-75% пациентов РА. По чувствительности при РА выявление АЦЦП сопоставимо с чувствительностью обнаружения ревматоидного фактора. В тоже время, выявление ревматоидного фактора (РФ) недостаточно специфично для РА. РФ выявляется при многих аутоиммунных и инфекционных заболеваниях, низкие титры РФ в пожилом возрасте  могут отмечаться у 10-15%  лиц не больных РА. В отличие от РФ, специфичность обнаружения АЦЦП превосходит 95%. Антитела АЦЦП не встречаются у здоровых лиц, а вероятность обнаружения АЦЦП при других воспалительных поражениях суставов не превышает 2-3% случаев. Среднее содержание АЦЦП у здоровых доноров крови в 10 раз меньше, чем рекомендуемая производителем граница нормы.

Большим преимуществом антител АЦЦП/CCP является их появление задолго до начала клинических проявлений заболевания. Популяционные исследования, посвященные времени появления аутоантител АЦЦП в ходе РА, показали, что АЦЦП могут быть обнаружены задолго до развития клинических симптомов заболевания. До появления клинических симптомов заболевания в 34% случаев были обнаружены антитела к циклическому цитруллиновому пептиду. У 19% здоровых на момент обследования людей, был обнаружен ревматоидный фактор класса IgM (РФ IgM), причем в нескольких случаях появление антител предсказывало РА за 20 лет до появления симптомов заболевания. Частота обнаружения антител значительно нарастала к моменту, соответствующему 1,5 годам до постановки диагноза РА. После выявления минимального диагностического титра содержание антител обычно увеличивалось вплоть до срока постановки диагноза.

Таким образом, раннее выявление АЦЦП в дебюте заболевания, учитывая высокую клинико-диагностическую специфичностью этого показателя, делает АЦЦП крайне важным методом диагностики РА в дебюте суставного синдрома. Антитела к цитруллиновым антигенам могут отмечаться у многих пациентов, у которых с момента появления симптомов симметричного артрита мелких суставов кисти и утренней скованности не прошло 2-3 недель и ревматоидный фактор еще отсутствует.

Антитела к АЦЦП не только обнаруживаются на ранних стадиях РА, но и отмечаются у больных РА с быстрым рентгенологическим прогрессированием. Результаты анализа литературных данных показывают, что антитела к циклическому пептиду позволяют предсказать развитие деструкции приблизительно у 80% пациентов с РА и, в сочетании с РФ, представляют важный инструмент для раннего распознавания больных РА с неблагоприятным прогнозом заболевания уже на этапе установления диагноза. У пациентов с тяжелым течением РА, у которых выявлены высокие титры АЦЦП, может быть лучше эффект назначения анти-В-клеточной терапии. Хорошие клинико-диагностические характеристики выявления АЦЦП/APCA позволили включить их международные критерии ревматоидного артрита ACR/EULAR 2010 года (см. раздел диагностика ревматоидного артрита).

Референсные значения:   

• <30 RU/ml - антител не обнаружено; 
• 30-90 RU/ml  - низкие концентрации антител; 
• >90 RU/ml - высокая концентрация антител.

Интерпретация:

Выявление антител к циклическому цитруллиновому пептиду (АЦЦП/CCP/ACPA) значительно повышает вероятность диагноза ревматоидный артрит. На этапе раннего симметричного артрита обнаружение АЦЦП совместно выявлением ревматоидного фактора обладает максимальной чувствительностью составляющей 80-85%. Анализ содержания антител и его сопоставление с характером артрита и воспалительной реакцией рекомендуется проводить в соответствии с критериями диагностики ревматоидного артрита ACR/EULAR 2010 г.

Отрицательный результат исследования снижает вероятность заболевания и практически исключает вероятность тяжелого РА. Анализ результатов определения аутоантител целесообразно проводить совместно с оценкой содержания ревматоидного фактора, определения антинуклеарного фактора на НЕр2 клетках и типирования HLA-B27. Большинство пациентов с антителами к цитруллинированному виментину также положительны в отношении антител к модифицированному цитруллиновому виментину (MCV).

1. Маслянский А.Л., Лапин С.В., Мазинг А.В., Булгакова Т.В., Лазарева Н.М., Чешуина М.Д., Олейник П.А., Иливанова Е.П., Тотолян А.А., Мазуров В.И. Диагностическая значимость серологических маркеров ревматоидного артрита. Научно-практическая ревматология. 2012. № 5 (54). С. 20-24.
2. Гусева В.И., Лапин С.В., Маслянский А.Л., Мячикова В.Ю., Чухловин А.Б., Иванова Н.Е., Ткаченко О.Ю., Блинова Т.В., Тотолян Арег А.  Клиническое значение определения генов локуса HLA-DRB1 при ревматоидном артрите. Медицинская иммунология, 2019. Т. 21, No 2. С. 333-340.
3. Лапин С.В., Маслянский А.Л. лабораторная диагностика ревматоидного артрита : новые перспективы. Клинико-лабораторный консилиум. 2009. № 1. С. 69-74.
4. Жугрова Е.С., Мазуров В.И., Лила А.М., Сысоев К.А., Лапин С.В., Тотолян А.А. динамика цитокинового статуса у больных ревматоидным артритом на фоне применения инфликсимаба (ремикейда). Медицинская иммунология. 2008. Т. 10. № 2-3. С. 251-260. 
5. Кузнецова П.А., Маслянский А.Л., Лапин С.В., Ткаченко О.Ю., Мазуров В.И. Антитела к гетерогенному ядерному рибонуклеопротеину В1 (RA33) при ревматоидном артрите и системной склеродермии.  Научно-практическая ревматология. 2017. Т. 55. № 2. С. 151-155.
6. Кузнецова П.А., Маслянский А.Л., Лапин С.В., Мазинг А.В., Бэнг Х., Мазуров В.И. Антитела к различным посттрансляционным модификациям виментина у больных ревматоидным артритом. Современная ревматология. 2017