Оценка риска тромбоза и акушерской патологии при антифосфолипидном синдроме
Определение и критерии
Антифосфолипидный синдром (АФС) является аутоиммунным заболеванием, которое резко увеличивает риск развития артериального/ венозного тромбозов и/или патологии беременности и характеризуется наличием антифосфолипидых антител (АФА). В 1999 году международные эксперты разработали клинические и лабораторные критерии для диагностики «АФС», который стали известны как критерии Саппоро. Впоследствии эти критерии были пересмотрены в 2006 году на в Сиднее. Клинические критерии включают объективно подтвержденный венозный, артериальный или тромбоз мелких сосудов или патологию беременности, ассоциированную с плацентарной недостаточностью, включая невынашивание беременности или преждевременные роды. Лабораторные критерии требуют, чтобы положительный лабораторный тест на антифосфолипидные антитела (АФА) был обнаружен в 2 или более случаях с интервалом не менее 12 недель. В критерии включены антикардиолипиновые антитела (aКЛ) класса IgG или IgMв средних или высоких титрах, антитела против β2-гликопротеина I (аβ2-ГПI) классов IgG или IgM и волчаночный антикоагулянт (ВАК) .
Иммунопатогенез
С иммунологической точки зрения антифосфолипидные антитела (АФА) представляют собой семейство антител, которые взаимодействуют с фосфолипидами (ФЛ), фосфолипидно-белковыми комплексами и фосфолипид-связывающими или «ко-факторными» белками. Патогенетически-значимые АФА реагируют со скрытым эпитопом белков ко-факторов, т.е. связывание аутоантител и белка является конформационно-зависимым. Естественный антикоагулянт и иммунорегулирующий белок β2-гликопротеин 1(β2ГП1) является наиболее подробно изученным ко-фактором АФА, который, при взаимодействии с фосфолипидами, изменяет конформацию и экспонирует неоэпитоп в домене 1. Особые имуногенные структуры домена 1 становятся мишенями патогенных АФА, в отличие от низкопатогенных АФА, которые могут реагировать с другими структурными доменами молекулы. К основным протромбогенным механизмам относятся взаимодействие АФА с плазменным гемостазом, а также системой антикоагулянтов, однако показано воздействие аутоантител на тромбоциты и эндотелиоциты. Описано множество моделей действия аутоантител in vitro и in vivo, как связанных с нарушениями в системе коагуляции, так и опосредованных воздействием на иммунные, стромальные, эндотелиальные, плацентарные клетки, которые приводят к широкому спектру патогенных реакций.
Рисунок 1. Взаимодействие антифосфолипидных антител с молекулой бета2-гликопротеин I: при связывании с фосфолипидным бислоем экспонируется скрытый эпитоп домена 1 молекулы бета2ГП, что позволяет аутоантителам взаимодействовать с аутоантигеном.
Помимо классических АФА были изучены другие многочисленные АФА, направленные на фосфолипиды клеточных мембран, такие как антитела против фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, которые могут определяться у пациентов с клиническими проявлениями АФС как вместе с aКЛ, аβ2-ГПI, ВАК, так и изолированно. Выделяют антитела к отрицательно-заряженным и нейтральным фосфолипидам, в том числе, антитела к кардиолипину (аКл), фосфатидилсерину (аФС), фосфатидилэтаноламину (аФэм) и ряд других фосфолипидов.
Их изолированная детекция лежит в основе выявления пациентов с так называемым серонегативным АФС, т.е. рецидивирующими тромбозами и невынашиванием беременности с отрицательными аКЛ, аβ2-ГПI, ВАК. Диагностическое значение антител к фосфолипидам клеточных мембран обычно ставят под сомнение, однако постепенно накапливаются экспериментальные и клинические данные свидетельствующие об обратном. В частности, антитела к трем анионным фосфолипидам, таким как фосфатидилсерин (аФс), фосфатидилинозитол (аФи) и фосфатидная кислота (аФк), часто выявляются при АФС. Хотя выявление данных антител не улучшает диагностику АФС по сравнению с классическими лабораторными критериями, однако спектр аутоантител, включающий аФС, аФК, аФИ может быть информативен при оценке риска рецидива невынашивания беременности. In vitro было показано, что антитела, направленные против ФС, ингибируют развитие и инвазию трофобласта. Кроме того, aФС может замедлять образование синцитиотрофобластов и снижать синтез ХГЧ. Антитела, направленные против фосфатидилэтаноламина (аФэ), выявлялись у пациентов с клиническими проявлениями АФС изолированно, и по этой причине они заслуживают особого внимания. Некоторые аФЭ могут связываться с высокомолекулярным кининогеном, что приводит к образованию тримолекулярного комплекса аФЭ-кининоген, который усиливает индуцированную тромбином агрегацию тромбоцитов. Так aФЭ значительно чаще встречается у женщин с необъяснимой ранней потерей плода, более того, в нескольких исследованиях сообщалось о взаимосвязи аФЭ с необъяснимыми венозными тромбозами.
Также описаны антифосфолипидные антитела к другим ко-факторным белкам плазмы, таким как протромбин и аннексину V. Как и бета2-гликопротеин эти белки способны менять конформацию при взаимодействии с фосфолипидным бислоем. В связи с этим отмечается способность АФА реагировать с фосфолипид-связывающими белками на мембранах разных типов клеток, что приводит, в конечном итоге, к их активации. При АФА-ассоциированном невынашивании беременности, АФА взаимодействуют с человеческим трофобластом, что ведет к повреждению клеток и апоптозу, ингибированию пролиферации, формирования синцития, снижению выработки хорионического гонадотропина, нарушению секреции факторов роста и нарушению естественных инвазивных свойств.
Риск повторных тромбозов и подходы к его оценке
АФС сопровождается высоким риском повторных тромбозов, которые может быть эффективно предотвращены посредством своевременного назначения профилактической антикоагулянтной терапии. Одной из важных задач тактики лечения АФС является идентификация пациентов с высоким риском рецидивирующих клинических проявлений АФС. Среди классических АФА ВАК наиболее значимо ассоциирован с тромбозами и акушерскими осложнениями. Титр АФА (aКЛ и анти-β2GГПI) также рассматривается в рамках оценки риска развития тромбозов и привычных невынашиваний беременности. Согласно международным рекомендациям АФА, класса IgG в среднем и высоком титрах считаются более высоким фактором риска для клинических проявлений АФС по сравнению с низким титром и IgMизотипом. При определении риска развития тромбоза большое значение придают спектру выявляемых АФА. В нескольких исследованиях была продемонстрирована тесная связь между профилем выявляемых АФА (ВАК, аКЛ, аβ2ГП I) и клиническими проявлениями АФС. Так Pengo et al. в 2010 при анализе спектра АФА у лиц с повторными тромбозами при АФС обнаружили, что одновременное выявление нескольких аутоантител позволяет определить риск развития тромбоэмболического события или выкидыша.
Рисунок 2. Увеличение риска тромбоза по мере увеличения числа показателей, включая ВАК, аКЛ, аβ2ГП I (по Pengo et al., 2010)
В попытке количественно оценить вероятность развития тромбозов Otomo et al. в 2012 разработали диагностический комплекс тестов АФА (aPL-s), включающий 5 коагуляционных тестов для детекции ВАК и 6 ИФА тестов (аКл класса IgG/IgM, аß₂ГП1 класса IgG/IgM, фосфатидилсерин-зависимые аПр класса IgG/IgM). В данном исследовании АФА профиль каждого пациента был индексирован, определен в формате «антифосфолипидной шкалы» (aPL-S) и ретроспективно проанализирован относительно риска тромботических событий у пациентов с аутоиммунными заболеваниями (см. таблицу 1). aPL-S индекс значимо коррелировал с риском тромботических событий, и в группе наиболее высокого риска состояли пациенты с индексом aPL-s>30.
Таблица 1. Шкала aPL-S – оценка риска развития клинических проявлений АФС
|
Тест |
Балл |
|---|---|
| АЧТВ тест смешения | 5 |
|
Подтверждающий тест, соотношение >1.3 |
2 |
|
Подтверждающий тест, соотношение >1.1 |
1 |
|
Каолиновое время свертывания |
8 |
|
Тест с разведенным ядом гадюки Рассела (ВАК) |
4 |
|
Подтверждающий тест, соотношение >1.3 |
2 |
|
Подтверждающий тест, соотношение >1.1 |
1 |
|
аКл IgG, высокие титры |
20 |
|
аКл IgG, низкие титры |
4 |
|
аКл IgМ |
2 |
|
аß2ГП1 IgG, высокие титры |
20 |
|
аß2ГП1 IgG, низкие титры |
6 |
|
аß2ГП1 IgM |
1 |
|
Антитела к Ps/Pt IgG, высокие титры |
20 |
|
Антитела к Ps/Pt IgG, низкие титры |
13 |
|
Антитела к Ps/Pt IgM |
8 |
Примечание: АЧТВ – активированное частичное тромбиновое время, aß2ГП1 - антитела к β2-гликопротеину 1, аКл – антитела к кардиолипину, aPS-PT – антитела к комплексу фосфатидилсерин-протромбин, ВАК – волчаночный антикоагулянт
Для количественной оценки риска тромбоза и патологии беременности Sciascia et al.. 2013 была разработана шкала GAPSS, представляющая глобальную оценку АФС. Для этого был проведен анализ нескольких комбинаций независимых факторов риска тромбоза, определения профиля АФА, уточнения сердечно-сосудистых факторов риска, а также спектра других аутоантител (см таблицу 2). Концепция GAPSS позволяет рассматривать АФА не только как диагностический биомаркер для АФС и СКВ, но и как предиктор развития тромбозов и патологии беременности. Индекс GAPSS рассчитывается для каждого пациента путем сложения баллов, соответствующих факторам риска. Более высокий индекс у пациентов с тромбозами, тромбозами и патологией беременности, с рецидивирующими тромбозами. Индекс GASSP >11 - самая высокая чувствительность и специфичность при определении риска повторных тромбозов при антифосфолипидном синдроме.
Таблица 2. Шкала GAPSS – оценка риска развития клинических проявлений АФС
|
Фактор |
Заголовок |
|---|---|
|
аКЛ IgG/IgM |
5 |
|
аß2ГП1 IgG/IgM |
4 |
|
ВАК |
4 |
|
aPS-Pt антитела |
3 |
|
Гиперлипидемия |
3 |
|
Артериальная гипертензия |
1 |
Примечание: aß2ГП1 - антитела к β2-гликопротеину 1, аКл – антитела к кардиолипину, aPS-PT – антитела к комплексу фосфатидилсерин-протромбин, ВАК – волчаночный антикоагулянт
В рекомендациях Европейской лиги против ревматических заболеваний (EULAR) по лечению АФС 2017 года выявление ВАК (в 2 или более случаях в течение 12 недель), двойная (любая комбинация ВАК, антитела к aCL или антибета2-гликопротеин I антитела) или тройная (все три подтипа) АФА-позитивности, наличие постоянно высоких титров АФА, классифицируются как спектр АФА высокого риска, который требует проведения незамедлительной иммуносупрессивной и антикоагулянтной терапии.
Таким образом, в диагностике АФС намечается общая тенденция, в которой важно не только установить диагноз АФС, но и выделить группы пациентов с высоким риском тромбозов, обусловленных антифосфолипидными антителами. Оценка риска осложнения особенно актуальна в акушерской практике, где нет возможности длительно наблюдать беременную с высокой вероятность акушерской патологии для подтверждения диагноза АФС. Более скрупулезное исследование традиционных АФА с помощью новых методов, определение уровней позитивности, оценка спектра редких АФА, присутствующих в сыворотке пациента, с помощью мультиплексных технологий, анализ сопутствующих факторов риска тромбозов представляют собой практические подходы в оценке рисков рецидивирующих тромбозов и акушерской патологии при АФС.
Новые методы выявления антифосфолипидных антител в оценке риска клинических проявлений АФС
В большинстве клинических лабораторий для измерения АФА используют ИФА тест-системы. В последние годы были опубликованы рекомендации по измерению АФА с использованием количественного ИФА. Они содержат информацию о типе анализируемой пробы, особенностях тестов, расчету референтного интервала и интерпретации результатов, но некоторые вопросы их практического использования остаются без ответа. Очевидно, что сбор, хранение и обработка проб для ИФА менее критичны по сравнению с коагуляционными тестами. Однако, сохраняются значительные межлабораторные и межлабораторные вариациями в результатах aКЛ и aβ2ГП1 с помощью разных ИФА тестов, несмотря на попытки стандартизации тестирования. Различия в результатах теста возникают из-за методологических проблем при выполнении анализов, различий в калибровке и отсутствия консенсуса в интерпретации как положительных или отрицательныхрезультатов. В нашем недавнем исследовании мы проанализировали сходимость 2-х ИФА тест-систем зарубежного производства для измерения аß₂ГП1. Мы исследовали пациентов с ранним(<50 лет) острым некардиоэмболическим инсультом, лиц с рецидивируюшими тромбозами глубоких вен нижних конечностей, а также пациенток с привычным невынашиванием беременности (всего n=127). Сходимость 2-х тест-систем ИФА для определения аβ2ГП1 составила 70%, для аКЛ IgG- 88%, для аКЛ IgM - 70%. При сопоставлении количественных результатов ИФА тест-систем разных производителей для детекции АФА значения каппа/коэффициента Коэна составили 0,045 для aß2ГП1, 0,061 - для аКл IgM, 0,068 – для аКл IgG. Таким образом, сходимость количественных результатов тест-систем разных производителей, популярных в лабораториях РФ, оказалась крайне низкой. Так как высокая вариабельность и низкая специфичность приводят к спорной клинической значимости АФА, целесообразно оценить преимущества новых методов детекции антител, способные преодолеть эти недостатки.
В течение последних нескольких лет были разработаны новые твердофазные методы иммунохимического выявления АФА. Данные методы характеризуются новыми подходами к сорбции антигена, обеспечивая большую плотность антигена на твердофазном носителе. Связывание молекул β2ГПIна твердой фазе имеет решающее значение, поскольку определяет конформационное изменения белка, необходимое для связывания аутоантител.
Мультиплексный лайн-дот (МЛД) для детекции антифосфолипидных антител или иммуноблот антифосфолипидных антител (тест 01.02.15.875) характеризуются единовременным выявлением нескольких АФА. Особенностью МЛД является использование гидрофобной мембраны из поливинилидендифторида (PVDF), которая обладает уникальными свойствами. В отличие от твердой фазы ИФА метода, обычно обладающей слабым отрицательным зарядом, пористая структура мембраны обладает высоким сродством к гидрофобной части фосфолипидов, что приводит к более плотному распределению фосфолипидов на поверхности мембраны, которая взаимодействует с кофакторами и специфическими аутоантителами. Это позволяет приблизить реакцию in vitro, к физиологическим условиям связывания аутоантител и антигена, которые происходят in vivo.
Рисунок 3. Взаимодействие антифосфолипидных антител с белковым ко-фактором (бета2-гликопротеином) на PVDV мембране и результат вывления антифосфолипидных антител с помощью теста иммуноблот антифосфолипидных антител классов IgG и IgM (тест 01.02.15.875)
В нашем исследовании мы проанализировали диагностическую ценность МЛД в постановке серологического диагноза АФС. Для измерения АФА мы использовали ИФА тест-системы для детекции аКЛ и аβ2ГПI, МЛД для детекции аКЛ, аβ2ГПI, антител к аннесину V (аАнн V), протромбину (аПТ), фосфатидной кислоте (аФК), фосфатидилинозитолу(аФИ), фосфатидсерину (аФС), фосфатидилхолину (аФХ), фосфатидилсерину(аФС), фосфатидилинозитолу(аФИ), фосфатидилэтаноламину (аФЭ) (Рисунок 1). Так как преимуществом метода МЛД является единовременная детекция спектра АФА, мы также оценили его использование для оценки риска клинических проявлений АФС. Для оценки роли МЛД в диагностике первичного АФС мы исследовали 3 группы пациентов, а именно 44 пациента с некардиоэмболическими ишемическими инсультами, 19 пациентов с рецидивирующими тромбозами глубоких вен нижних конечностей, 45 пациентов с двумя и более выкидышами. В качестве группы с вторичным АФС мы проанализировали 100 пациентов с системной красной волчанкой (СКВ). В качестве группы сравнения использовались сыворотки крови 50 здоровых доноров. Мы провели сравнительный анализ встречаемости aß2GP и аКл между методом МЛД и ИФА тест-системами двух разных производителей, именуемых в дальнейшем ПР1 и ПР2.
Большинство АФА при использовании ИФА тест-систем и метода МЛД в группах с первичным АФС были обнаружены в низком титре. При оценке встречаемости АФА мы не выявили преимуществ метода МЛД по сравнению с ИФА. Но при анализе частоты средних и высоких титров новый метод показал достоверно более высокую чувствительность для детекции главных маркеров АФС – аКл. Это позволяет избавиться от значительного числа низкоположительных неспецифических реакций АФА, которые могут быть обусловлены транзиторными непатогенными антителами. Значимость выявления АФА в средних и высоких титрах и более выраженная связь с клиническими проявлениями была описана рядом авторов и включена в международные критерии АФС.
Так как одним из преимуществ МЛД является возможность обнаружения 10 видов АФА, была оценена частота выявления как, аß2ГП1, аКл, так и других АФА - аФк, аФх, аФэм, аФг, аФэл, аФс, аАн V и аПр (Рисунок 2). В общей когорте пациентов чаще всего обнаруживались aß2GP1, аФс, аКл, аАн V, аФк. В группе пациентов с тромбозами глубоких вен нижних конечностей среди АФА чаще детектировались антитела к ФК (40%), к ФС (33%), к Анн V (22,1%), Пт (7,4%). У пациентов с острыми инсультами были обнаружены антитела к ФК (46,2%), к ФС (37,2%), к Анн V (13,3%), к ФИ (8,9%), к ПТ (8,9%), к ФГ (6,7%). У пациенток с акушерской патологией встречались антитела к Анн V (26%), к ФХ (15,9%), к ФГ (13,6%), к ФК (13,5%), к ПТ (9,4%), к ФИ (6,8%), к ФЭ (4,5%). У пациентов с тромботическими проявлениями (тромбозы глубоких вен нижних конечностей и острые инсульты) значительно чаще детектировались аФК IgG и IgM и аФс IgG и IgM (p=0,0093, OD=0,2355; p=0,0044, OD=0,2308).
Мы использовали новый метод МЛД для выявления АФА в группе пациентов с акушерской патологией и проанализировали спектр АФА антител. Для этого мы разделили пациенток с первичным АФС на группы с тройной позитивностью АФА (ВАК(+),аКЛ(+), аβ2ГП1(+)), с двойной позитивностью АФА (ВАК(+),аКЛ(-),аβ2ГП1(+)), и монопозитивностью АФА ((ВАК(+),аКЛ(-),аβ2ГП1(-)/ВАК(-), аКЛ(+),аβ2ГП1(-)/ВАК(-),аКЛ(-),аβ2ГП1(+)). Метод МЛД выявляет больше пациентов с тройной позитивностью АФА, тем самым позволяя более эффективно оценить риск развития патологии беременности и выделить группу наибольшего риска осложнений.
В когорте пациентов с СКВ (n=100) мы также исследовали распространенность АФА, измерив как ВАК, aКЛ IgG и IgM, аβ2ГП1 IgG и IgM, так и другие АФА - аФх, аФэм, аФг, аФэл, аФс, аФк, аАн V и аПр классов IgG и IgМ с помощью МЛД. Для этого мы разделили пациентов с СКВ на две группы: 55 пациентов с СКВ и тромбозам в анамнезе (СКВ-Тромбозы) и 45 пациентов без тромбозов в анамнезе (СКВ без тромбозов). У пациентов с СКВ и тромбозами в анамнезе (n=45) чаще выявлялись аКл IgG (38 %,p=0,0266) и aβ2ГПI IgG (47%, p=0,0018), определяемые с помощью ИФА, и аКл IgG (38 %,p=0,0402) и aβ2ГПI IgG (38%,p=0,0127), измеренные с помощью МЛД, по сравнению с пациентами с СКВ без тромбозов (12/9% аКл IgG, 16/9% aβ2ГПI IgG методами ИФА/МЛД), а также ВАК (56%/31%,p=0,0074).
Недавно было высказано предположение, что МЛД может быть полезным инструментом для того, чтобы отличить пациентов с АФС от бессимптомных носителей. Реактивность аКл и аβГПI IgG/IgM, оцененная с помощью МЛД, была значительно выше у пациентов с АФС, в то время как связывание иммуноглобулинов класса IgG с КЛ и β2ГПI было значительно ниже у носителей АФА. Это можно объяснить, тем что ФЛ на новой подложке имитируют их естественную конформацию, необходимую для связывания белковых кофакторов.
Мы проанализировали встречаемость аКЛ, аβ2ГП1 в группах СКВ-Тромбозы и СКВ без тромбозов в анамнезе, учитывая только высокие уровни антител, выявленные с помощью ИФА тест-систем (>40 Ед/мл), а также только высокоположительные результаты МЛД (>++60 ОП). В группе СКВ без тромбозов чувствительность обоих методов к различным титрам АФА не показала существенных различий. Но в группе СКВ-Тромбозы МЛД показал ту же чувствительность, что и ИФА для aКЛ IgG и IgM, но оказался был в три раза более чувствительным при обнаружении aβ2ГП1 классов IgM и IgG.
В нашем исследовании мы оценили и другие АФА, обнаруженные методом МЛД в группах СКВ-Тромбозы и СКВ без тромбозов в анамнезе. Нами было обнаружено, что аФС и аФИ класса IgG в 3,6 раза чаще встречались у пациенов с тромбозами в анамнезе, и таким образом, эти антитела могут быть использованы в качестве маркеров риска развития тромбозов у пациентов с СКВ. В группах СКВ-Тромбозы и СКВ без тромбозов мы также оценили АФА. Мы проанализировали обнаружение 1-3 и> 4 АФА IgM и IgG отдельно с помощью МЛД. В группе СКВ->4 маркера IgM и особенно IgG выявлялись значительно чаще пациентов с СКВ и тромбозами в анамнезе по сравнению с СКВ без клинических проявлений АФС.
Таким образом, метод мультиплексного лайн-блоттинга показывает более высокую чувствительность при детекции средних и высоких титров АФА, а также позволяет выявить пациентов с множественной серологической позитивностью. Наши данные указывают на то, что МЛД для выявления АФА, является эффективной мультипараметрической тест-системой для одновременного полуколичественного обнаружения спектра аутоантител в одном образце. Уникальные свойства этого метода позволяет рассматривать его как инструментом для оценки риска развития клинических проявлений АФC.
|
Таблица 3. Преимущества мультиплексного лайн-дота для детекции антифосфолипидных антител |
|---|
|
|