Полногенное молекулярно-генетическое исследование генов BRCA1 и BRCA2 методом NGS

История открытия BRCA

BRCA-ассоциированный рак молочной железы и яичников – первый наследственный рак с доказанной молекулярной основой. Ведущая роль в открытии гена BRCA принадлежит американскому генетику Мэри-Клер Кинг. Ещё во времена древних греков существовало представление о наследственной предрасположенности к некоторым опухолям. В 1866 г. француз Поль Брокá одним из первых обнаружил наследственную предрасположенность к раку молочной железы (РМЖ). Ученый описал десять случаев этого заболевания в четырех поколениях членов семьи его жены. И только в 1990 г. доктор Мэри Клэр Кинг подтвердила концепцию П. Брокá. Она обследовала 1500 пациенток из семей , в которых часто встречался РМЖ и применила к полученным данным статистические методы анализа. Она обнаружила, что в таких семьях риск развития РМЖ к 70-и года составляет 82%. Генетические исследования позволили выявить локус 17-й хромосомы, где находился предполагаемый ген или гены. Чуть позже в 1990 г. Мэри-Клер Кинг (и параллельно с ней компания Myriad Genetics) открыли ген BRCA1 (BReast Cancer Associated), а в 1995 г. был открыт ген BRCA2. Эти открытия ознаменовали начало эры онкогенетики.

Эпидемиология

Рак молочной железы (РМЖ) и рак яичников (РЯ) представляют собой важную медико-социальную проблему. РМЖ занимает лидирующее положение как в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями женского населения (20,1%), так и в структуре смертности от них (17,4%). Рак яичников (РЯ) находится на седьмом месте по распространенности среди всех злокачественных новообразований женского населения России (4,9%).

Генетическая предрасположенность является одним из основных факторов риска РМЖ и РЯ. Доля наследственно-обусловленного РМЖ колеблется от 5 до 10%. Наследственный РЯ встречается с частотой 10‑17%. Наследственные формы РМЖ и РЯ характеризуются аутосомно-доминантным типом наследования с высокой (неполной) пенетрантностью, более ранним (по сравнению со спорадическими формами) возрастом возникновения и более агрессивным типом течения.

По данным ряда исследований, 20‑50% наследственного РМЖ и 90‑95% наследственного РЯ (включая рак фаллопиевых труб и первичный рак брюшины) у женщин, а также от 4 до 40% РМЖ у мужчин обусловлены герминальными мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. С учетом синдромальной патологии наследственный РМЖ и РЯ может быть ассоциирован также с мутациями в генах TP53, CHEK2, MLH1, MSH2, PALB2, PTEN, NBS1, ATM, BRIP1, RAD50, BLM, FGFR2 и др.

Мутации BRCA (преимущественно BRCA2) также повышают риск развития других видов рака, таких как рак простаты, рак поджелудочной железы, рак желудка и меланома.

Частота встречаемости BRCA мутаций в популяции составляет 1:800-1:1000, при этом она зависит от географической локализации и этнической группы, например, в популяции евреев ашкенази она достигает 1:40.

Риск развития РМЖ у носителей мутаций в гене BRCA1 до 70 лет составляет 57‑65%, риск развития РЯ – 40%. Риск развития РМЖ в течение жизни для носителей мутаций в гене BRCA2 составляет 45‑49%, тогда как риск РЯ не превышает 11‑18%.

Во многих популяциях наблюдается так называемый эффект основателя («founder effect») — преобладание нескольких мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, специфичных именно для этой этнической группы. Существование эффекта основателя значительно упрощает генетическое тестирование и делает возможным разработку соответствующих скрининговых программ.

В российской популяции превалируют мутации в гене BRCA1, они составляют около 80% от общего количества мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, в то время как мутации, идентифицированные в гене BRCA2 (за исключением 6174delT), уникальны, что учитывается при формировании диагностической панели.

Согласно целому ряду исследований, преобладающей в России является мутация 5382insC в гене BRCA1, она составляет около 70% всех мутаций в этом гене BRCA1 при РМЖ и около 60% при РЯ. В гене BRCA1 часто встречаются мутации 4153delA, 300T>G (C61G), 185delAG. В нескольких российских исследованиях также выявлены мутации 2080delA, 3819delGTAAA, 3875delGTCT в гене BRCA1 и мутация 6174delT в гене BRCA2

Рис. 1. Спектр и частота мутаций BRCA1 (данные РОНЦ им. Н. Н. Блохина) [3]

Фенотипическая гетерогенность BRCA-ассоциированного РМЖ отмечена во многих исследованиях, в том числе и российских. Для наследственного РМЖ характерен более молодой возраст развития заболевания, преобладание инфильтративно-протокового рака. Около 80% BRCA1‑ассоциированных опухолей молочной железы являются трижды негативными (ER-, PR-, HER2 / neu‑), но только 10% ранних трижды негативных опухолей являются BRCA1‑позитивными. У носителей мутаций в гене BRCA1 чаще встречаются трижды негативные опухоли.

У больных РМЖ носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 значительно повышен риск развития контралатерального РМЖ: кумулятивный риск через 25 лет после постановки первичного диагноза РМЖ составляет 47,4%. Максимальный риск развития контралатерального РМЖ (62,9 %) отмечен при манифестации первичного РМЖ в возрасте до 40 лет, в то время как риск развития контралатерального РМЖ у носителей мутаций в гене BRCA1, заболевших после 50 лет, не превышает 19,6%.

Для наследственного BRCA1‑ассоциированного РЯ также характерен более молодой в сравнении со спорадическим РЯ возраст развития заболевания — 48 против 56 лет. Гистологический тип наследственного РЯ чаще представлен серозной сосочковой цистаденокарциномой (70‑80 %), редко встречаются муцинозные опухоли (0‑1 %).

Пенетрантность мутаций не является полной и зависит как от внутригенных (тип мутации, местоположение, сочетание с однонуклеотидными полиморфизмами), так и от экзогенных факторов (популяционных факторы и факторы внешней среды). Стиль жизни, репродуктивное поведение во многом определяют временные рамки реализации наследственной предрасположенности. Пенетрантность для РМЖ находится в диапазоне от 41% до 90%, а пенетрантность мутаций для РЯ составляет от 8% до 62%.

Таблица 1. Риск развития различных видов рака при наличии патогенных герминальных мутаций (вариантов) BRCA1 и BRCA2 [1].

Дифференциальная диагностика.

Существуют другие семейные / наследственные опухолевые синдромы помимо BRCA1- и BRCA2-ассоциированного наследственного РМЖ/РЯ, которые могут иметь сходную клиническую симптоматику: синдром Ли-Фраумени, синдром Линча, синдром Пейтца-Егерса, синдром Коудена и др. Для проведения дифференциального диагноза необходим тщательный анализ индивидуального и семейного анамнеза (выявление информации о различных опухолях и их сочетаниях) и генетическое тестирование.

Таблица 2. Синдромы, ассоциированные с наследственным РМЖ [3]

Патогенез BRCA1/2-ассоциированных опухолей

Гены BRCA1 и BRCA2 локализованы на 17-й и 13-й хромосомах соответственно. Согласно современным представлениям, BRCA1/2 проявляют себя как классические опухолевые супрессоры. Функционирование этих генов вовлечено в репарацию двхцепочечных разрывов ДНК путем гомологичной рекомбинации, участвующей в процессе поддержания стабильности генома. Утрата их функции влечет за собой ошибки репарации повреждений ДНК, вследствие чего активизируются гены контроля клеточного цикла, ингибирующие дальнейший рост клеток с возникшими генетическими аномалиями и индуцирующие программированную клеточную гибель – апоптоз. Накопление ошибок репарации, приводящих к нарушениям регуляции клеточного цикла, апоптоза и дифференцировки клетки и, как следствие, к генетической нестабильности, является ключевым событием в процессе канцерогенеза.

При наследственном РМЖ для инициации опухолевого роста, помимо герминальной мутации необходима инактивация второго аллеля, которая происходит в соматической клетке. Инициирующим моментом инактивации может служить как соматическая мутация, так и ряд эпигенетических событий, таких как аномальное метилирование.

Рис. 2. Схематическое изображение функционирования генов BRCA1/2 и нарушения при инактивации их функциональной активности [3]

Генотипирование BRCA1, BRCA2 для выявления наследственных состояний.

Генотипирование BRCA1, BRCA2 провидится для диагностики наследственных форм рака молочной железы и яичников, поджелудочной железы, предстательной железы. При выявлении наследственного рака показано обследование ближайших кровных родственников пациента.

Генотипирование BRCA1, BRCA2 для назначения PARP-ингибиторов.

Генотипирование BRCA1, BRCA2 играет важную роль для определения показаний к терапии PARP-ингибиторами.

Ингибиторы PARP — современная группа таргетных противоопухолевых препаратов, которые блокируют фермент поли(АДФ-рибоза)-полимеразу (PARP). Ферменты PARP-1 и PARP-2 участвуют в работе одной из шести известных систем репарации повреждений ДНК – эксцизионной репарации. Ингибирование PARP нарушает работу эксцизионной репарации, что в условиях дефицита функции другого пути репарации ДНК – гомологичной рекомбинации – приводит к апоптозу опухолевых клеток. Одной из наиболее частых причин нарушения работы гомологичной рекомбинации является потеря функции белков BRCA1 или BRCA2 за счет инактивирующих мутаций, что делает группу PARP-ингибиторов наиболее эффективной именно при опухолях с герминальными или соматическими мутациями BRCA.

Показания к назначению ингибитора PARP олапариб (линпарза) с учетом выявлении мутаций BCRA:

• Рекомендуется добавление олапариба в рамках поддерживающей терапии у пациенток с герминальной или соматической мутациями генов BRCA1/2 при соблюдении всех следующих условий: 1) серозная карцинома высокой степени злокачественности; 2) объективный ответ после последней платиносодержащей ХТ, назначенной по поводу платиночувствительного рецидива

• Олапариб в комбинации с бевацизумабом одобрен к применению в качестве поддерживающей терапии после первой линии у пациенток с распространенным раком яичников, у которых выявлен дефицит гомологичной рекомбинации (мутации генов BRCA и/или геномная нестабильность).

• Олапариб зарегистрирован для лечения HER2-негативного метастатического рака молочной железы с герминальными мутациями генов BRCA после химиотерапии

• Олапариб зарегистрирован для лечения метастатического рака поджелудочной железы с герминальными мутациями генов BRCA.

• Олапариб зарегистрирован для лечения метастатического кастрационно-резистентного рака предстательной железы с мутациями генов гомологичной рекомбинации (BRCA1/2 или ATM).

Клинические рекомендации МЗ РФ предусматривают выполнение BRCA-тестирования пациентам со следующими заболеваниями [5-9]:

1) Рак молочной железы

- у женщин с подтвержденным РМЖ при отягощенном семейном анамнезе (наличие у близких родственников: РМЖ в возрасте ≤50 лет, рака яичников или маточных труб, рака поджелудочной железы, РМЖ у родственников мужского пола, метастатического рака предстательной железы)

- у женщин с подтвержденным РМЖ в возрасте ≤45 лет

- у женщин ≤60 лет с тройным негативным фенотипом РМЖ

- при первично-множественном РМЖ (включая, но не ограничиваясь установленным диагнозом рака контрлатеральной молочной железы, рака яичников или маточных труб, рака поджелудочной железы)

- при РМЖ у мужчин

Примечание: рак молочной железы включает как инвазивный рак, так и протоковую карциному in situ.

2) серозные и эндометриоидные карциномы яичников высокой степени злокачественности

3) рак поджелудочной железы

4) рак предстательной железы

- местнораспространенный рак предстательной железы с метастазами в регионарных лимфоузлах

- метастатический кастрационно-резистентный рак предстательной железы

Международные критерии тестирования на герминальные мутации BCRA1/2 при уже выявленном РМЖ [4]:

• Семейный анамнез рака молочной железы, яичников/маточных труб/брюшины, поджелудочной железы или агрессивного рака простаты.

• Возраст на момент постановки диагноза <50 лет

• Трижды негативный РМЖ (ER-, PgR-, HER2-отрицательный)

• РМЖ у мужчин

• РМЖ, диагностированный в любом возрасте у евреев ашкенази

• Рак яичников или поджелудочной железы в анамнезе у данного пациента.

• Обнаружение соматической мутации BRCA1/2.

• Пациентки с метастатическим HER2-отрицательным раком молочной железы, подходящие под критерии терапии ингибиторами PARP.

Лабораторная диагностика

Для определения полной нуклеотидной последовательности кодирующей части генов BRCA1 и BRCA2 могут быть использованы такие методики секвенирования следующего поколения (Next-Generation Sequencing, NGS) и секвенирование по Сэнгеру. Преимуществом NGS является секвенирование всех кодирующих областей генов BRCA1/2 и возможность выявлять точечные мутации, небольшие делеции и вставки. Недостатком методики является невозможность выявления протяженных делеци и дупликаций, однако мутации данного типа редко встречаются в генах BRCA1, BRCA2.

Проведение BRCA-тестирования определяется действующими клиническими рекомендациями Минздрава РФ: либо метод анализа не регламентирован, либо место NGS-тестирования обозначено клиническими рекомендациями.

На тестирование может быть отправлен один из двух возможных биоматериалов: венозная кровь (в пробирке с сиреневой крышкой) или материал опухоли в гистологических блоках. При выявлении соматической мутации в опухоли рекомендуется проведение исследование в крови пациента для исключения наследственной формы злокачественного образования.

Профилактический осмотр и скрининг у носителей мутаций

Носителей мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и других включают в специализированный клинико-генетический регистр с последующим диспансерным наблюдением с привлечением междисциплинарной команды специалистов (онкологов, хирургов-маммологов, гинекологов, химиотерапевтов, психологов и других).

Отрицательный результат тестирования позволяет исключить высокий генетически-детерминированный риск развития РМЖ и РЯ, однако не исключает общепопуляционный риск и необходимость проведения стандартных скрининговых программ.

Важно отметить, что если мутации в генах, ассоциированных с развитием РМЖ и/или РЯ (BRCA1, BRCA2 и др.), не обнаружены, но личный и / или семейный анамнез не позволяет исключить наследственную природу заболевания, пациенты остаются под активным динамическим наблюдением в условиях онкодиспансера, программа которого должна быть такой же интенсивной, как и для выявленных носителей мутаций. Кроме этого, таким пациентам рекомендуется расширенное исследование других генов, ассоциированных с наследственными случаями РМЖ и РЯ.

Рекомендации для ранней диагностики РМЖ и РЯ у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» включают [2]:

1. самообследование молочных желез — 1 раз в месяц с 18 лет;

2. ультразвуковая компьютерная томография (УЗКТ) молочных желез, маммография в сочетании с магнитно-резонансной томографией (МРТ) — 1 раз в год с 25 лет (или иного возраста с учетом семейного анамнеза);

3. трансвагинальное ультразвуковое исследование органов малого таза (или в сочетании с допплерографией) — 1 раз в 6 месяцев с 25 лет;

4. определение уровня маркеров СА-15.3, СА-125‑1 раз в 6 месяцев с 25 лет;

5. консультации гинеколога и маммолога — 1 раз в 6‑12 месяцев с 18 лет.

Маммография является стандартным тестом для скрининга РМЖ. МРТ рекомендована как высокочувствительный дополнительный к маммографии метод для женщин с высоким риском развития РМЖ. Чувствительность при комбинации этих двух методов достигает 94%.

Ранняя диагностика РЯ представляет собой важную проблему онкогинекологии. Теста, подобного по своей эффективности маммографии для диагностики РМЖ, для РЯ не разработано. Лучшей тактикой на сегодняшний день является сочетание трансвагинального ультразвукового исследования и определения уровня опухоль-ассоциированного антигена СА-125 с периодичностью проведения у носительниц мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 1 раз в 6 месяцев с 25 лет.

Для мужчин из группы риска скрининг на рак молочной железы включает ежемесячное самообследование молочных желез, а также ежегодное клиническое обследование молочных желез, начиная с 35 лет. Ежегодный скрининг на общий простатоспецифический антиген (PSA) и пальцевое ректальное исследование показано с 45 лет для профилактики рака простаты.

Профилактическое обследование на предмет выявления рака поджелудочной железы (на основании наличия мутаций и семейного анамнеза рака) включает контрастную МРТ или МР-холангиопанкреатографию и/или УЗИ в качестве скрининга.