Серологическая и молекулярно-генетическая диагностика целиакии

Первым этапом лабораторной диагностики целиакии является исследование сыворотки крови на специфические маркеры заболевания. К специфическим для целиакии антителам относят:

• антитела к тканевой трансглутаминазе (TGА)

• антитела к эндомизию (EMA)

• антитела к деамидированным пептидам глиадина (DGP)

Для всех специфических для целиакии антител верны следующие правила:

• Приоритетным являются скрининговые тесты на основе IgA, поскольку он вырабатывается в слизистой кишечника (правило верно при отсутствии селективного дефицита IgA)

• Все тесты на основе IgA необходимо сочетать с определением общего IgA с целью исключения селективного дефицита IgA

• Исследование должно проводиться до введения безглютеновой диеты во избежание ложно-отрицательных результатов. Детям раннего возраста имеет смысл проводить серологическое исследование только после введения прикорма.

• Тесты на основе IgG не используются для скрининга. Они показаны при селективном дефиците IgA.

• Антитела могут использоваться как для первичного скрининга, так и для мониторинга эффективности безглютеновой диеты

Тесты обладают разной чувствительностью и специфичностью:  

Чувствительность и специфичность различных серологических маркеров целиакии [4]

Антиген	Тип антител	Чувствительность, %	Специфичность, %
Тканевая трансглутаминаза-2	IgA	98 (78–100)	98 (90–100)
	IgG	70 (45–95)	95 (94–100)
Эндомизий	IgA	95 (86–100)	99 (97–100)
	IgG	80 (70–90)	97 (95–100)
Деамидированные пептиды глиадина	IgA	88 (74–100)	90 (80–95)
	IgG	80 (70–95)	98 (95–100)
Глиадин*	IgA	85 (57–100)	90 (47–94)
	IgG	80 (42–100)	80 (50–94)

*тесты на антитела класса IgG или IgA к нативному глиадину не рекомендуется использовать в клинической практике для диагностики целиакии; они имеют только историческое значение

В метаанализе ESPGHAN было показано, что тест на антитела к тканевой трансглутаминазе-2 класса IgA (TGA-IgA) характеризуется большей специфичностью, а тест на антитела к эндомизию класса IgA (EMA-IgA) — большей чувствительностью (специфичность тестов 0,957 и 0,827, чувствительность — 0,936 и 0,987 соответственно). В связи с этим ESPGHAN рекомендует в первую очередь проводить исследование на TGA-IgA, чтобы исключить пациентов, у которых нет целиакии. При положительном результате скринингового теста рекомендовано определение антител к эндомизию. Тестирование на антитела к эндомизию (EMA), деамидированным пептидам глиадина (DGP) или нативному глиадину (AGA) классов IgG и IgA в качестве скрининга не рекомендуется (ESPGHAN 2020 г).

Ниже представлена подробная информация обо всех специфических антителах.

Антитела к тканевой трансглутаминазе-2

Тканевая трансглутаминаза представляет собой фермент, который широко распространен во многих органах. Интестинальная форма трансглутаминазы (TG2), которая экспрессируется в кишечнике, является основной мишенью антител при целиакии. Основной функцией транглутаминазы является образование поперечных сшивок белков соединительной ткани, что делает их механически прочными и устойчивыми к протеолизу. Повышенная активность тканевой трансглутаминазы в стенке кишечника приводит к дезаминированию молекул альфа-глиадина, в результате чего образуются устойчивые к протеолизу дезаминдированные фрагменты белка – дезамидированные пептиды глиадина (ДПГ). Эти фрагменты (ДПГ) имеют высокое сродство к HLA-DQ8/DQ2 аллелям белков основного комплекса гистосовместимости, носительство которых предрасполагает к развитию целиакии. В результате сенсибилизации тканевая трансглутаминаза и фрагменты глиадина становятся иммунногенными и вызывают гуморальный и клеточный иммунный ответ.

Выявление антител к тканевой трансглутаминазе класса IgA является базовым методом ранней диагностики (скрининга) целиакии. Для диагностики рекомендуется использовать тесты второго поколения, основанные на рекомбинантной тканевой трансглутаминазе человека. Тесты первого поколения, в которых использовался очищенный антиген лабораторных животных, не рекомендованы для клинического использования. Результатом использования тестов первого поколения может быть гипердиагностика целиакии, что приводит к ошибочному назначению пожизненной безглютеновой диеты.

Выявление аутоантител к TG2 обязательно сочетать с исследованием концентрации иммуноглобулина А (IgA) в сыворотке крови (ESPGHAN 2020 г). Тестирование проводится до введения безглютеновой диеты.

• Согласно предложенному ESPGHAN в 2020 г. алгоритму, при нормальной (соответствующей возрасту) концентрации общего IgA и отрицательном тесте на антитела класса IgA к трансглутаминазе-2 (TGA-IgA) диагноз целиакии исключается/крайне маловероятен.
• При нормальной концентрации общего IgA и уровне антител TGA-IgA ≥10 х ВГН, рекомендуется определение АТ класса IgA к эндомизию (EMA-IgA) во втором образце сыворотки. При положительном тесте на EMA-IgA диагноз целиакии считается подтвержденным без биопсии. Обоснованием для такой рекомендации является ассоциация между тяжестью атрофии слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки и концентрацией TGA-IgA, данные получены в ходе ретроспективных исследований.
• При низком титре антител класса IgA к трансглутаминазе 2 (<10 х ВГН) показано выполнение биопсии слизистой тонкой кишки с целью снижения риска ложно-положительного диагноза целиакии. Низкие уровни антител к тканевой трансглутаминазе также могут быть обнаружены при ряде аутоиммунных заболеваний, инфекциях, опухолях, повреждении миокарда и печени и псориазе.
• При недостаточности синтеза IgA необходимо использовать тесты для выявления специфических аутоантител класса IgG. При низкой концентрации общего иммуноглобулина класса IgA сыворотки крови (ниже возрастной нормы) обследование должно включать по крайней мере один тест для выявления специфических аутоантител класса IgG. В этом случае у детей младше 5 лет целесообразно выявлять антитела к дезамидированным пептидам глиадина класса IgG, в более старшем возрасте - антитела к тканевой трансгулутаминазе класса IgG. Антитела к трансглутаминазе класса IgG уступают по специфичности антителам класса IgA, поэтому при их использовании диагноз целиакии должен быть основан на комплексе клинических, лабораторных, инструментальных и морфологических данных.

Антитела к эндомизию

Антитела к эндомизию были впервые описаны в 1983 году и с тех пор широко используются в диагностике целиакии. Эндомизий представляет собой соединительную ткань, окружающую мышечные клетки, которая содержит в себе нервы и сосуды, осуществляющие трофику мышцы. Эндомизиальные волокна в поперечнополосатой мускулатуре тонки, в то время как в гладкой мускулатуре эндомизий составляет опорную основу (строму) мышечных слоев. Основными белками эндомизия являются коллаген и эластин. В процессе их синтеза они подвергаются модификации с помощью фермента тканевой трансглутаминазы. Именно TG2 является основным антигеном антител к эндомизию при целиакии.

В ранней диагностике целиакии антитела к эндомизию класса IgA обладают чувствительностью около 95% и специфичностью, превышающей 98%. В связи с использованием метода непрямой иммунофлюоресценции с использованием нативных антигенов выявление антител к эндомизию хорошо стандартизировано, что позволяет использовать этот показатель в качестве референтного теста для подтверждения выявления антител другими методами.

Для подтверждения диагноза целиакии выявление высоких титров антител к тканевой трансглутаминазе (TG2) класса IgA (≥10 х ВГН) с помощью теста второго поколения должно быть подтверждено обнаружением антител к эндомизию класса IgA во втором образце сыворотки крови. В этом случае диагноз целиакии может быть установлен без проведения эндоскопического исследования и биопсии (рекомендации ESPGHAN 2020 г).

Чувствительность выявления аутоантител может быть несколько ниже у детей до 2 лет в связи с низкой выработкой иммуноглобулина IgA, а также у лиц с селективным IgA дефицитом и у обследуемых, получающих иммуносупрессивную терапию.

Антитела к деамидированным пептидам глиадина.

Основной причиной целиакии является иммунная реакция против модифицированных фрагментов глиадина. Глиадин представляет собой алкоголь-растворимую фракцию глютена, который, в свою очередь, является компонентом глютенопектина (белковой части) злаковых. Глютен обеспечивает эластичность мучного теста и благодаря этому свойству широко используется для приготовления не только хлебобулочных изделий, но и многих других пищевых продуктов. Еще одной причиной развития целиакии является незрелость плотных контактов между клетками слизистой тонкого кишечника у детей, поскольку она приводит к проникновению в подслизистую фрагментов альфа-глиадина. Повышенная активность интестинальной тканевой трансглутаминазы в стенке кишечника приводит к дезаминированию молекул альфа-глиадина, в результате чего образуются устойчивые к протеолизу фрагменты глиадина. Эти линейные антигены хорошо охарактеризованы и получили название – дезамидированные пептиды глиадина (ДПГ). Тканевая трансглутаминаза и фрагменты глиадина (ДПГ) становятся иммунногенными и вызывают гуморальный иммунный ответ.

Тесты первого поколения для выявления антител к нативному глиадину классов IgG и IgA были сравнительно неспецифичны, поскольку данные антитела выявлялись при множестве заболеваний желудочно-кишечного тракта, воспалениях, бактериальных и вирусных инфекциях. В настоящее время тесты первого поколения для выявления антител к нативному глиадину не рекомендованы для клинического применения.

Тесты второго поколения, которые используют в качестве антигенов линейные дезамидированные пептиды глиадина (ДПГ), значительно чувствительнее и специфичнее (до 95% и до 98% соответственно). При целиакии антитела к деамидированным пептидам глиадина класса IgA чаще отмечаются у детей, чем у взрослых, при целиакии у детей менее 5 лет антитела к ДПГ могут быть выявлены при отрицательных результатах определения антител к тканевой транглутаминазе класса IgA. При анализе результатов исследования важно обратить внимание, что на момент исследования пациент должен получать богатую глиадином диету в течение не менее одной недели, кроме того в крови обследуемого должна присутствовать достаточное количество иммуноглобулина А (IgA).

Поскольку клинико-лабораторные параметры выявления антител к дезамидированному глиадину класса IgA уступают выявлению антител к трансглутаминазе и эндомизию, антитела к дезамидированному глиадину класса IgA могут использоваться в качестве дополнительных тестов для диагностики целиакии.

При низкой концентрации IgA сыворотки крови (ниже возрастной нормы) обследование должно включать по крайней мере один тест для выявления специфических аутоантител класса IgG. Антитела к деамидированным пептидам глиадина класса IgG должны использоваться для диагностики целиакии у лиц с селективным дефицитом синтеза IgA совместно с выявлением антител к тканевой трансглутаминазе класса IgG.

Антитела к ретикулину

Антитела к ретикулину не являются критериальными и имеют второстепенную роль для диагностики целиакии, тем не менее, рассмотрим их в данном разделе. Ретикулин состоит из волокон основного вещества соединительной ткани, участвующих в образовании трехмерных сетчатых структур, образующих строму паренхиматозных органов. Исторически описано несколько разновидностей антител к ретикулиновым волокнам, получившим название R1, R2, R3 и R4. В настоящее время установлено, что основным антигеном антител против R1 волокон в составе стенки тонкой кишки и печени, является тканевая транслутаминаза TG2. В то же время, часть антител к ретикулину аутоантител реагирует с другими компонентами волокон, прежде всего, актином, который выступает в качестве минорной мишени антител, характерных при целиакии. Другими антигенами антиретикулиновых антител являются белки соединительной ткани - десмин и кальретикулин.

Антитела к ретикулину (R1) класса IgA выявляются у 20-40% пациентов с целиакией. Существует перекрестная реактивность высоких титров антител к тканевой трансгутаминазе класса IgA и антител к ретикулину R1. Антитела к ретикулину класса IgG менее чувствительны для целиакии и могут встречаться при ряде воспалительных состояний.

Комбинированные тесты

Скрининг целиакии (тест 01.02.15.211)

• антитела к рекомбинантной тканевой трансглутаминазе-2 класса IgA

• антитела к деамидированным пептидам глиадина класса IgG

Антитела к рекомбинантной тканевой трансглутаминазе-2 класса IgA являются базовым скрининговым тестом на целиакию при нормальном уровне общего IgA.

Антитела к деамидированным пептидам глиадина класса IgG у детей младше 5 лет могут быть выявлены при отрицательных результатах определения антител к тканевой транглутаминазе и антител к эндомизию класса IgA.

Уточнение диагноза целиакии (тест 01.02.15.215)

• антитела к рекомбинантной тканевой трансглутаминазе 2 класса IgA

• антитела к эндомизию класса IgA,

• антитела к рекомбинантной тканевой трансглутаминазе 2 класса IgG

Антитела к рекомбинантной тканевой трансглутаминазе-2 класса IgA являются базовым скрининговым тестом на целиакию при нормальном уровне общего IgA.

Антитела к эндомизию класса IgA являются подтверждающим тестом.

Антитела к рекомбинантной тканевой трансглутаминазе 2 класса IgG информативны у пациентов с селективным дефицитом IgA.

Полное серологическое обследование при целиакии (тест 01.02.15.221)

• антитела к рекомбинантной тканевой трансглутаминазе 2 класса IgA и IgG

• антитела к эндомизию класса IgA

• антитела к деамидированным пептидам глиадина класса IgA и IgG

• антитела к ретикулину класса IgA и IgG

Тест представляет собой максимально полное развернутое серологическое обследование при целиакии.

Молекулярно-генетическое исследование при целиакии (гены HLA-DQ2, HLA-DQ8)

В настоящее время накоплено достаточно данных, позволяющих расценивать целиакию как генетически детерминированное заболевание. Среди ближайших родственников больных частота целиакии составляет 20%, а конкордантность среди монозиготных близнецов достигает 86%. Доказана ассоциация целиакии с антигенами главного комплекса гистосовместимости человека (HLA), расположенными на 6р21 хромосоме. Гаплотип HLA-DQ2 выявляется у 90-95% пациентов, HLA-DQ8 - у остальных 5-10%. Отсутствие в генотипе типичных для целиакии аллелей делает развитие заболевание крайне маловероятным.

Центральным событием патогенеза целиакии является презентация пептидов глиадина в составе молекул HLA-DQ2/DQ8 глютен-специфическим CD4+ Т лимфоцитам с последующим развитием иммуновоспалительного процесса в слизистой оболочке тонкой кишки (СОТК). Важную роль в модификации пептидов глиадина играет тканевая трансглутаминаза-2 (TG2). Под действием TG2 в молекуле глиадина формируются отрицательно заряженные эпитопы, что повышает сродство (аффинность) пептидов к соответствующим связывающим участкам молекул DQ2 и DQ8 и способствует прочному соединению HLA молекулы с рецепторами Т лимфоцитов.

Носительство гаплотипов HLA-DQ2/DQ8 не позволяет поставить диагноз целиакии, поскольку в популяции Северной Европы они высоко распространены (до 30%). Только у небольшого числа лиц, имеющих HLA-DQ2 и HLA-DQ8 в геноме  (менее 3%), развивается целиакия. Таким образом, выявление аллелей, предрасполагающих к целиакии, используется для исключения заболевания, но не для его подтверждения.

Отсутствие гаплотипов HLA-DQ2 и HLA-DQ8 фактически исключает диагноз целиакии и требует проведения дополнительных лабораторных и инструментальных исследований для определения другой причины симптоматики. Серологическая диагностика с выявлением антител к тканевой трансглутаминазе и антител к эндомизию является предпочитаемым методом постановки диагноза целиакии (рекомендации ESPGHAN 2020 г).

Генетическое типирование может быть использовано для исключения диагноза целиакии в сложных диагностических случаях. Ценность генетических маркеров при этом определяется тем, что они не зависят от того, находится ли пациент в момент исследования на безглютеновой диете или нет. Молекулярно-генетическое исследование на характерные для целиакии гаплотипы HLA-DQ2/DQ8, по мнению ESPGHAN, является полезным скрининговым методом исследования для исключения целиакии у лиц из групп риска или у пациентов, которые начали придерживаться безглютеновой диеты еще до проведения диагностических тестов.

Ранее HLA-генотипирование входило в «тройные критерии» постановки диагноза целиакии без биопсии ESPGHAN 2012 г. (TGA-IgA ≥10 ВГН, EMA-IgA+, HLA-DQ2/DQ8+), однако оно было исключено из пересмотренных критериев ESPGHAN 2020 г. В целом, рекомендуется отказаться от рутинного использования HLA-генотипирования (независимо от проведения диагностики целиакии без биопсии или с биопсией), и выполнять его только в специальных случаях (см. выше). 

Другие статьи по теме:

Целиакия: история изучения, эпидемиология, патоморфология, клиническая картина

Критерии и алгоритмы диагностики целиакии ESPGHAN 2020 г.

Диагностика целиакии у взрослых

Обследование пациентов с установленным диагнозом целиакия

Диагностика целиакии у детей и взрослых без боли