Возможности электрофореза белков в клинической диагностике (вебинар). Лапин С.В.

Парапротеин – лабораторный биомаркер плазмоклеточных опухолей и других лимфопролиферативных заболеваний, определение которого необходимо для диагностики, оценки эффективности проводимой терапии и мониторинга. В данной лекции приведены основные методы качественного и количественного анализа моноклональных белков: изложены особенности, возможности и ограничения гельэлектрофореза, капиллярного электрофореза, иммунофиксации и нефелометрии. Рассмотрены основные источники ошибок и артефактов при выполнении этих исследований. Обращено внимание на трудности в диагностике и интерпретации результатов исследования сыворотки и мочи.

Состояния, характеризующиеся пролиферацией клона плазмоцитов, синтезирующих моноклональный иммуноглобулин или парапротеин, называются моноклональными гаммапатиями. Одними из важных диагностических маркеров данной группы заболеваний являются концентрация свободных легких цепей (СЛЦ) иммуноглобулинов — каппа и лямбда, а также величина их соотношения. Кроме того данные показатели можно использовать для оценки эффективности лечения этих состояний. На сегодняшний день наиболее распространенным подходом измерения уровня СЛЦ является метод Freelight, основанный на нефелометрическом определении СЛЦ с помощью поликлональных антител. Цель исследования — валидация иммуноферментной тест-системы для определения уровня СЛЦ в сыворотке крови. Материал и методы. В эксперимент было включено 254 образца: 89 сывороток от здоровых доноров и 165 — от больных моноклональными гаммапатиями. Определение уровня СЛЦ проводили методом ИФА на отечественных реактивах фирмы «Полигност», основанного на моноклональных антителах. Полученные результаты сопоставлялись с результатами выявления парапротеинов методом иммунофиксации («HelenaBiosciences», Великобритания). Результаты. В ходе исследования были определены аналитические характеристики набора, в том числе, предел обнаружения и диапазон линейности. По данным показателям отечественная тест-система была сопоставима с реактивами производителя Freelight. Определение диапазонов нормальных значений проводили на сыворотках доноров. Полученные значения для каппа-СЛЦ (3,25—15,81 мкг/мл), лямбда-СЛЦ (3,23—28,05 мкг/мл) и для соотношения каппа-СЛЦ/лямбда-СЛЦ (0,3—1,9) практически совпали с таковыми, рекомендованными производителем Freelight. При обследовании группы больных с парапротеинемиями было выявлено достоверное (р<0,01) повышение уровня СЛЦ по сравнению с контрольной группой. Также наблюдалось достоверное изменение (р<0,01) величины соотношения каппа-СЛЦ/лямбда-СЛЦ при моноклональных гаммапатиях. Вывод. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что отечественный ИФА-набор можно использовать в лабораторной практике при диагностике моноклональных гаммапатий, так как он обладает хорошими аналитическими и диагностическими характеристиками.

Парапротеинемия – синдром, при котором в крови обнаруживается моноклональный компонент, синтезируемый клоном В-клеток. Существуют различные варианты моноклонального синтеза, поэтому парапротеин может быть представлен целой молекулой иммуноглобулина или ее фрагментами, а также их сочетанием. Электрофорез с иммунофиксацией является чувствительным методом, позволяющим установить наличие/отсутствие интактной молекулы иммуноглобулина. С помощью этой технологии можно произвести качественную и количественную оценку парапротеина, определить его состав. Однако данных методов недостаточно для выявления тех случаев, когда происходит синтез парапротеина, представленного свободными легкими цепями. В этом случае используют аналитически более чувствительные методы. Для оценки уровня свободных легких цепей наибольшее распространение получили нефелометрия или иммуноферментный анализ. Так как у разных больных парапротеин имеет различный состав, то для диагностики парапротеинемии необходимо использовать комплекс методов, позволяющий выявлять как молекулу иммуноглобулина, так и свободные легкие цепи.

Содержание свободных легких цепей (СЛЦ) иммуноглобулинов каппа и лямбда, а также соотношение их концентраций в сыворотке крови являются важными диагностическими и прогностическими маркерами при моноклональных гаммапатиях. Одним из общепринятых способов определения содержания СЛЦ является метод FreelightTM, основанный на нефелометрическом выявлении СЛЦ с помощью поликлональных антител. Целью данного исследования была валидация отечественной тест-системы для определения уровня СЛЦ в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА). Мы собрали образцы сыворотки крови 89 здоровых доноров и 165 больных моноклональными гаммапатиями. Для определения уровня СЛЦ мы использовали ИФА тест-систему фирмы «Полигност», основанную на применении моноклональных антител. Мы определили ряд аналитических характеристик набора реактивов, в том числе предел обнаружения и диапазон линейности. Предел обнаружения СЛЦ ИФА тест-системы был в 2 раз ниже, чем заявленный производителем нефелометрического набора FreelightTM; таким образом, аналитические характеристики ИФА-набора позволяют определять уровень СЛЦ в диапазоне нормальных значений. Мы установили референтные границы концентрации каппа-СЛЦ (3,25—15,81 мкг/мл),лямбда-СЛЦ (3,23—28,05 мкг/мл) и их соотношения (0,3—1,9) в сыворотке крови, которые практически совпали с рекомендованными интервалами для набора FreelightTM. У больных с моноклональными гаммапатиями уровень СЛЦ был достоверно выше (p < 0,01) по сравнению с контрольной группой условно здоровых доноров. При парапротеинемиях наблюдалось достоверное изменение (p < 0,01) соотношения каппа-СЛЦ/лямбда-СЛЦ по сравнению с контрольной группой. Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что отечественный ИФА-набор обладает хорошими аналитическими и диагностическими характеристиками и может быть использован в лабораторной практике.

Электрофорез с иммунофиксацией представляет собой чувствительный метод выявления парапротеина (ПП) и определения его состава при моноклональных гаммапатиях (МГ). Альтернативным способом оценки клональности ПП является иммунометрическое определение концентрации свободных легких цепей (СЛЦ) иммуноглобулинов, основанное на изменении абсолютного или относительного содержания СЛЦ в сыворотке крови, возникающего в результате феномена рестрикции легких цепей при моноклональном синтезе. В настоящее время для скрининга и мониторинга МГ рекомендовано определение соотношения СЛЦ в сыворотке крови. Для сравнения информативности определения СЛЦ и электрофореза с иммунофиксацией для диагностики МГ мы обследовали 89 здоровых доноров и 165 больных МГ, получающих лечение в гематологических стационарах. Во всех образцах был выполнен электрофорез с иммунофиксацией с помощью оборудования и реактивов для электрофореза (Helena Biosciences, Великобритания). Концентрация СЛЦ была измерена с помощью набора для определения СЛЦ методом иммуноферментного анализа (ООО «Полигност», Россия). Референсные границы концентрации каппа-СЛЦ составили 3,25–15,81 мкг/мл, лямбда-СЛЦ — 3,23–28,05 мкг/мл, а и их соотношения — 0,3–1,9 в сыворотке крови. У больных с ПП, содержащим легкую цепь каппа, увеличение абсолютного содержания каппа-СЛЦ отмечалось в 67,68 % (67 из 99) случаев, а увеличение индекса каппа/лямбда СЛЦ в 62,63 % (62 из 99) случаев (p < 0,01). При ПП, содержащем легкую цепь лямбда, увеличение СЛЦ лямбда встречалось у 69,7 % (46 из 66), а снижение индекса каппа/лямбда в 80,3 % (53 из 66) случаев. Таким образом, мы рекомендуем использовать комбинацию определения СЛЦ с расчетом индекса и иммунофиксации, которая обеспечивает наибольшую чувствительность лабораторной диагностики МГ.

Лапин С.В., Мазинг А.В., Эмануэль В.М. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ ПАРАПРОТЕИНЕМИЙ. ОСНАЩЕНИЕ СОВРЕМЕННОЙ ЛАБОРАТОРИИ. Справочник заведующего КДЛ. 2011. № 6. С. 17.